重組羧肽酶B酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒
使用說(shuō)明書(shū)
（96T）
使用前請仔細閱讀說(shuō)明書(shū)。若有任何問(wèn)題，請聯(lián)系我們。
試劑盒用途
該試劑盒用于體外定量檢測大腸菌液體中重組羧肽酶B含量。本試劑盒僅供研究或工業(yè)生產(chǎn)使用。
試劑盒基本參數
靈敏度 < 1 ng/ml
檢測范圍：0.25 - 64 ng/ml
特異性：可檢測重組羧肽酶B，與其它重組大腸菌表達系統相關(guān)蛋白無(wú)明顯交叉反應。
重復性：板內，板間變異系數均 < 10%。
工作時(shí)間：熟練實(shí)驗人員可在2.5小時(shí)內完成一次測定。
有效期：6個(gè)月
試劑盒組成及保存
未拆封的試劑盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒，請拆開(kāi)試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。
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中文名稱(chēng) |
規格 |
保存條件 |
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抗體包被的ELISA酶標板（96孔可拆卸) （MicroELISA Plate(Dismountable) |
8孔×12條 |
-20℃ |
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凍干標準品（40ng/支）(A1) （Reference Standard） |
4支 |
2-8℃ |
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濃縮辣根過(guò)氧化物酶化抗體 (A2)（Concentrated HRP-Detection Ab） |
1支×0.2 mL |
-20℃ |
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標準品 & 樣品稀釋液 (P1) （Reference Standard & Sample Diluent） |
1瓶×20 mL |
2-8℃ |
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HRP-抗體稀釋液 (P2) （HRP- Ab Diluent） |
1瓶×15 mL |
2-8℃ |
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濃縮洗滌液-1（25 X）(P3) （Concentrated Wash Buffer (25x)） |
2瓶×20 mL |
2-8℃ |
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濃縮洗滌液-2（25 X）(P4) （Concentrated Wash Buffer (25x) |
2瓶×10 mL |
2-8℃ |
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顯色底物（TMB）(A3) （Substrate Reagent） |
5支×0.125 mL |
-20℃ 避光 |
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底物稀釋液（TMB）(P5) （Substrate Reagent） |
1瓶×15 mL |
2-8℃ 避光 |
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反應終止液 (P6)（Stop Solution） |
1瓶×10 mL |
2-8℃ |
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封板覆膜（可重復使用） （Plate Sealer） |
5張 |
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產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（User Manual） |
1份 |
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質(zhì)檢報告（Certificate of Analysis） |
1份 |
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說(shuō)明:
1、所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染。
2、酶標板-20℃可存放6個(gè)月，4℃存放勿超過(guò)一周。
試驗所需自備物品
2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水
4.吸水紙
待測樣品注意事項
1.樣品收集后若在1周內進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內檢測），或 -80℃（3個(gè)月內檢測），避免反復凍融。
2.試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品值，請根據實(shí)際情況，做適當倍數稀釋后再測。
3.若使用化學(xué)裂解液制備的樣本或細胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會(huì )導致ELISA測值出現偏差。
檢測前準備工作
1.請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。提前15分鐘打開(kāi)酶標儀預熱。
2.洗滌液配制
將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋?zhuān)?：25）。
提示:從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可用40℃水浴加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過(guò)50℃，使用時(shí)洗滌液溫度應為室溫）。請當日使用。
3.標準品配制
將標準品于1000轉/分離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0 mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為32ng/ml）, 然后進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诜磻字羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)＝ㄗh配制成以下濃度: 32、 16、 8、 4、 2、 1、0.5 ng/ml。樣品稀釋液直接作為空白孔0 ng/ml。
倍比稀釋方法
取7只EP管，每管中加入500 μL標準品&樣品稀釋液，從32 ng/ml的標準品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL樣品稀釋液的EP管中混勻配成16 ng/ml的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。
標準品稀釋圖例（以500 μL為例）
提示：一管直接作為空白孔。
4.HRP標記抗體工作液配制
實(shí)驗前請先將抗體管低速離心，以避免管壁及管蓋上殘留抗體。實(shí)驗前計算實(shí)驗所需用量（以100 μL /孔計算），實(shí)際配制時(shí)應多配制100-200 μL。使用前15分鐘，用抗體稀釋液將HRP-標記抗體稀釋為工作濃度（抗體：稀釋液 = 1：62.5），當日使用。
5.TMB顯色工作液配制
實(shí)驗前計算實(shí)驗所需用量（以100 μL /孔計算），實(shí)際配制時(shí)應多配制100-200 μL。使用前15分鐘，用底物稀釋液將TMB顯色底物稀釋為工作濃度（底物：稀釋液 =1：20），當日使用。
洗滌方法
操作步驟
1.將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個(gè)濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL，若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標板覆膜并置于37℃孵育60分鐘。
提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間控制在10分鐘內。
2.洗滌：棄去液體，甩干，在潔凈厚吸水紙上拍干。每孔加入洗滌液350 μL，浸泡2-3分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉板內液體，在潔凈厚吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。
3.每孔中加入HRP-抗體工作液100 μL，混勻，酶標板覆膜并置于37℃孵育30鐘。
4.洗滌：用 洗滌液1 洗板3次，方法步驟同2。
5.洗滌：用 洗滌液2 洗板2次，方法步驟同2。，
6.每孔加底物顯色工作液（TMB）100 μL，酶標板覆膜并置于37℃條件下孵育10分鐘。
提示: 根據實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長(cháng)，顯色時(shí)間在5-30分鐘范圍內。當標準孔出現明顯梯度時(shí)，即可終止。
7.每孔加終止液50 μL，終止反應，室溫放置1分鐘。
提示: 終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時(shí)移液槍槍頭切不要接觸孔內溶液以避免污染，影響實(shí)驗結果。
8.用酶標儀在450 nm波長(cháng)（參考波長(cháng)650nm）測量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。
提示: 請提前打開(kāi)酶標儀電源，預熱儀器，設置檢測程序。
結果判斷
1.計算每組復孔的平均OD值。每個(gè)標準品的平均OD值減去空白孔的OD值作為矯正值。以標準品的濃度為橫坐標（X），OD值為縱坐標（Y），繪出標準曲線(xiàn)（作圖時(shí)亦可去掉空白組的值）。
2.推薦使用專(zhuān)業(yè)的曲線(xiàn)制作軟件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（請使用Logistic五參數擬合曲線(xiàn)計算方法繪制標準曲線(xiàn)）等。
3.若樣品OD值高于標準曲線(xiàn)上限，應適當稀釋后重測。
4.典型數據
由于實(shí)驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩定條件等），標準曲線(xiàn)的OD值會(huì )有所差異。以下數據和曲線(xiàn)僅供參考，實(shí)驗者需根據自己的實(shí)驗建立標準曲線(xiàn)。
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X-濃度（ng/mL） |
32 |
16 |
8 |
4 |
2 |
1 |
0.5 |
0 |
|
Y-OD450/650nm |
1.816 |
1.370 |
0.801 |
0.403 |
0.227 |
0.150 |
0.114 |
0.081 |
|
Y-OD450/650 nm（去本底） |
1.735 |
1.289 |
0.720 |
0.322 |
0.146 |
0.069 |
0.033 |
0 |
|
回收量（ng/mL） |
32.02 |
15.97 |
8.05 |
3.92 |
2.02 |
1.06 |
0.54 |
— |
|
回收率% |
100.1 |
99.8 |
100.6 |
98.0 |
101.0 |
106.0 |
108.0 |
— |
注意事項
10、不同批號的試劑盒組分不能混用（洗滌液和終止液除外）。
問(wèn)題分析
若實(shí)驗結果有問(wèn)題，請及時(shí)對顯色結果拍照，并妥善保存未使用板條及試劑，然后聯(lián)系技術(shù)支持。也可參考以下信息找出原因。
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問(wèn)題描述 |
可能原因 |
相應對策 |
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標準曲線(xiàn)梯度差 |
吸液或加液不準 |
檢查移液器和吸頭 |
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標準品稀釋不正確 |
溶解標準品時(shí)稍微旋轉瓶身，輕輕混勻使粉末完全溶解 |
|
|
洗滌不完全 |
保證洗滌時(shí)間和洗滌次數及每孔的加液量 |
|
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顯色很弱或無(wú)色 |
溫育時(shí)間太短 |
保證充足的溫育時(shí)間 |
|
實(shí)驗溫度不正確 |
使用推薦的實(shí)驗溫度 |
|
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試劑體積不夠或漏加 |
檢查吸液及加液過(guò)程，保證所有試劑按順序足量添加 |
|
|
稀釋不正確 |
||
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讀數數值低 |
酶標儀設置不正確 |
在酶標儀上檢查波長(cháng)和濾光片裝置 |
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提前打開(kāi)酶標儀預熱 |
||
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變異系數大 |
加液不正確 |
檢查加液情況 |
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背景值高
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檢測抗體的工作濃度過(guò)高 |
使用推薦的稀釋倍數 |
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酶標板洗滌不完全 |
重新仔細閱讀操作步驟，保證每步清洗完全;如果用自動(dòng)洗板機，請檢查所有的出口是否有堵塞;是否使用試劑盒配備的洗滌液。 |
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洗液有污染 |
配制新鮮的洗液 |
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靈敏度低 |
ELZSA試劑盒保存不當 |
按說(shuō)明書(shū)要求保存相關(guān)試劑 |
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讀數前未終止 |
OD讀數前應在每孔中加入終止液 |
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