SMA是一種常染色體隱性遺傳的神經(jīng)肌肉病，常見(jiàn)于嬰幼兒，主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、肌張力低、腱反射減弱等，大部分患兒在不到兩周歲時(shí)死亡，幸存者也會(huì)在成年后喪失大部分運(yùn)動(dòng)能力，需要在輪椅上生活。反義核苷酸Nusinersen是目前唯一獲批可用于此病的藥物。

       人類(lèi)的SMN基因有兩種：SMN 1和SMN 2，兩者都位于5號(hào)常染色體，且非常相近，其編碼的SMN蛋白若缺失，會(huì)導(dǎo)致脊髓中的α神經(jīng)元死亡，引起脊髓型肌萎縮。SMN蛋白主要由SMN 1基因表達(dá)，當(dāng)其缺失或突變體純合時(shí)，SMN 2基因能部分抵消其產(chǎn)生的缺陷，但SMN 2基因中一個(gè)堿基異位突變時(shí)，造成其轉(zhuǎn)錄的mRNA前體在剪接時(shí)容易丟失7號(hào)外顯子，因此只能產(chǎn)生10%-20%的正常SMN蛋白，造成SMA。目前對(duì)SMA的治療除上述提及的反義核苷酸Nusinersen外，也有通過(guò)基因替換或小分子調(diào)節(jié)的方式，但都還處于研究中。脊髓性肌萎縮癥在人群中的攜帶率約為1/35-1/50左右，發(fā)病率約為1/6000-1/10000左右。

       Hit compound的發(fā)現(xiàn)

       由于SMA是一種典型的信使RNA前體剪接異常造成的關(guān)鍵蛋白表達(dá)障礙，而mRNA剪接過(guò)程較為復(fù)雜，涉及到多個(gè)因素，因此Novartis采用高通量表型篩選技術(shù)，以期能夠得到可調(diào)節(jié)SMN 2基因RNA剪接的小分子化合物。

       在NSC34運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞系中運(yùn)用Minigene技術(shù)作為篩選方法，對(duì)大約1.4ⅹ106個(gè)化合物進(jìn)行篩選，不到1%的化合物有響應(yīng)，以噠嗪為核心骨架的化合物表現(xiàn)出較好的效果，得到代表性化合物1?；衔镌诟咄繙y(cè)試條件下，EC50=3.5 μM，相比DMSO的控制組，SMN 2 報(bào)告基因信號(hào)增強(qiáng)了1700%，在小鼠的SMN ELISA測(cè)試中，EC50 = 0.6 μM，SMN蛋白表達(dá)水平提高了2.5倍，在人類(lèi)SMA患者的細(xì)胞模型中，SMN蛋白表達(dá)水平提高了1.5倍，但是該化合物的血漿清除率較高，口服生物利用度也僅有18%，而且還存在hERG抑制活性，因此需要進(jìn)一步的藥物化學(xué)優(yōu)化。

       化合物優(yōu)化

       在對(duì)化合物進(jìn)行藥物化學(xué)優(yōu)化前，分析其結(jié)構(gòu)可知，1以噠嗪環(huán)為中心結(jié)構(gòu)，左側(cè)是一個(gè)苯并噻吩的芳環(huán)結(jié)構(gòu)，右側(cè)通過(guò)一個(gè)雜原子（胺）與哌 啶環(huán)相連，因此在進(jìn)行優(yōu)化研究時(shí)，可按照上述的分析進(jìn)行優(yōu)化。

       在芳環(huán)體系的優(yōu)化中，將CH衍生為N或者變換N的取代位置，常常會(huì)對(duì)化合物的活性以及理化性質(zhì)產(chǎn)生非常明顯的效果！早期的噠嗪環(huán)含兩個(gè)鄰位的氮原子，將氮原子變換位置和刪減，并未獲得較為理想的結(jié)果，此外，將六元環(huán)調(diào)整為五元噻唑環(huán)，活性表現(xiàn)降低。在噠嗪環(huán)上進(jìn)行甲基取代優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)4位取代的活性要高于5位取代，但是活性還是低于無(wú)取代。

       噠嗪核的優(yōu)化結(jié)果顯示，保留其起始結(jié)構(gòu)是選擇，在對(duì)右側(cè)四甲基哌 啶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，降低哌 啶環(huán)的親脂性將會(huì)引起活性的下降，而將堿性的哌 啶環(huán)用醚環(huán)取代，如呋喃，發(fā)現(xiàn)活性完全喪失，不過(guò)這兩種修飾方式都能降低hERG結(jié)合活性，由上述結(jié)果可知右側(cè)四甲基哌 啶環(huán)的堿性和親脂性是化合物是提高SMN蛋白水平的重要因素，而連接哌 啶環(huán)和噠嗪核的linker，用醚鍵替代效果類(lèi)似。

       左側(cè)的苯并噻吩環(huán)在優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)耐受性較好，能夠容忍多種芳環(huán)、芳雜環(huán)的取代，因此該位置不僅可以用于優(yōu)化化合物的活性，還可以調(diào)整化合物的理化性質(zhì)和ADME特征。初步優(yōu)化時(shí)，將苯并噻吩替換為噻吩，發(fā)現(xiàn)化合物活性喪失，而用苯并噻吩的電子等排體2-萘（6）取代時(shí)，活性保持，而1-萘基（5）則活性下降，主要是因?yàn)椴荒芘c噠嗪核保持一定的共平面性。當(dāng)芳環(huán)鄰位有取代時(shí)，大部分化合物活性喪失，但是當(dāng)芳環(huán)鄰位有羥基取代時(shí)，活性得到增強(qiáng)，但是也會(huì)造成較強(qiáng)的hERG抑制活性，將羥基用甲基封閉后，活性降低了近50倍！

       分析上述結(jié)果，左側(cè)芳環(huán)與噠嗪核的共平面性是決定活性的關(guān)鍵因素！對(duì)化合物4和其甲氧基取代化合物4-OMe的單晶結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)前者萘環(huán)平面與噠嗪環(huán)平面的二面角遠(yuǎn)小于后者，主要是因?yàn)榱u基和噠嗪環(huán)中的氮原子形成氫鍵作用，而當(dāng)羥基被替換為甲氧基后，氧的孤對(duì)電子與噠嗪環(huán)上的氮原子孤對(duì)電子的排斥作用，導(dǎo)致二面角增大，表現(xiàn)為活性降低或者喪失！

       經(jīng)過(guò)初步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，將得到的幾個(gè)體外活性較好的化合物，如化合物2、3和4進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)優(yōu)化成果，具體數(shù)據(jù)如表格所示?；衔?與1相比，只是將linker加了一個(gè)甲基，雖然對(duì)清除率影響不大，但是提高了化合物的血腦屏障透過(guò)率，主要是因?yàn)槠錅p少氫鍵供體的數(shù)量，除此之外，化合物2的AUC以及生物利用度得到了明顯的提高，基于上述發(fā)現(xiàn)，保留linker的甲基化是合理的！對(duì)比上述三個(gè)化合物，選擇化合物3進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)活性效果研究。

       以SMN delta7的小鼠為模型，不同劑量下SMN蛋白的表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)關(guān)系。采用三種不同劑量的化合物喂服模型小鼠，其存活時(shí)間明顯提高，但30 mg劑量下的總體表現(xiàn)低于10 mg劑量下的總體表現(xiàn)，表明化合物3存在一定的耐受性問(wèn)題，例如其較高的hERG結(jié)合活性。

       將3中的氰基用不同芳雜環(huán)取代，發(fā)現(xiàn)其修飾的耐受性較好，用吡唑替換后（7），活性略有提高，但是顯著降低了脫靶**，將linker用氧原子替代后，雖然活性未發(fā)生多大變化，但在SMN ELISA測(cè)試中，SMN蛋白表達(dá)水平略有提高，但是都未能改善hERG。

       在前期對(duì)右側(cè)哌 啶環(huán)的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)活性與其堿性和親脂性密切呈正相關(guān)，然而在生理pH條件下，與疏水中心鄰近的質(zhì)子化胺結(jié)構(gòu)是造成hERG結(jié)合活性的重要因素，因此，降低親脂性以及pKa就成為了首選優(yōu)化策略！以化合物7為模板，對(duì)右側(cè)的哌 啶環(huán)進(jìn)行修飾，均未能得到較好的結(jié)果，在改善hERG的情況下，活性也會(huì)損失！對(duì)左側(cè)芳環(huán)引入一些極性基團(tuán)，如將萘環(huán)替換為喹啉或異喹啉、吡唑連接位置調(diào)整、在吡唑上引入氨基、羥基等基團(tuán)等，在活性保持的同時(shí)，也降低了hERG結(jié)合性，但由于部分化合物PSA的增大，導(dǎo)致透過(guò)性降低，如8和12，由于氨基的引入，10的生物利用度僅有4%?；衔?和12的PK數(shù)據(jù)較為平衡，但是在SMN ELISA測(cè)試中，SMN蛋白表達(dá)水平只提高了2.6倍，而SMN表達(dá)效果的為12，有3.1倍之多。

       將化合物12的linker采用氧、亞甲基等替換，亞甲基（13）活性降低，但hERG結(jié)合性大有改善，氧取代和氮甲基取代，hERG性質(zhì)類(lèi)似，但氧取代的SMN蛋白表達(dá)水平（3.6倍），此外，氮甲基取代時(shí)（12）膜穿透性較差，因此優(yōu)選氧取代化合物進(jìn)入到臨床階段的，目前正在I/II期臨床研究，預(yù)計(jì)2020年完成！

       總 結(jié)

       mRNA前體的剪接是真核生物中基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。異常剪接會(huì)引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變，是疾病發(fā)生的一個(gè)常見(jiàn)原因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大約1/3的致病變異會(huì)引mRNA的異常剪接，基于Minigene技術(shù)的表型篩選方法，為攻克此類(lèi)疾病的治療提供了重要的方法，通過(guò)表型篩選得到理想的化合物后，再利用相關(guān)技術(shù)確認(rèn)作用靶點(diǎn)，此類(lèi)策略是開(kāi)發(fā)First in class藥物非常有效的方法。在化合物的優(yōu)化過(guò)程中，優(yōu)化化合物構(gòu)型、調(diào)整親脂性以及堿性，不僅會(huì)影響到化合物的ADME，而且是改善hERG性質(zhì)的重要方式。

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