幽門(mén)螺桿菌( Helicobacter pylori，Hp) 是一種革蘭陰性微需氧螺旋桿狀細菌，感染性強，可特異性定植于胃黏膜表面，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤、胃癌等上消化道疾病密切相關(guān)。目前，用于根除 Hp 的抗菌藥物主要包括大環(huán)內酯類(lèi)(如克拉霉素)、硝基咪唑類(lèi)(如甲硝唑) 、氟喹諾酮類(lèi)(如左氧氟沙星) 、阿莫西林、呋喃唑酮、四環(huán)素以及利福平。部分抗菌抗物可阻斷細菌核酸的合成，如甲硝唑、利福平、左氧氟沙星；部分可阻斷細菌核糖體的合成，如克拉霉素、四環(huán)素；部分可影響細菌細胞壁的合成如阿莫西林。由于抗菌藥物耐藥率不斷上升，導致Hp 根除率逐漸下降，解決抗菌藥物耐藥的問(wèn)題成為根除Hp的關(guān)鍵，而抗菌靶基因突變、細胞屏障或外排系統發(fā)生改變、細菌球形變以及與耐藥相關(guān)的酶分泌等一系列原因均可使細菌逃避抗菌藥物的活性而導致細菌耐藥。
靶基因突變
DNA促旋酶屬細菌裂解酶，維持著(zhù)細胞內正常的 DNA 螺旋結構，與DNA 復制、轉錄、重組以及修復密切相關(guān)。有研究表明，氟喹諾酮類(lèi)藥物是有效的 DNA 促旋酶抑制劑，可導致不可逆性的細菌 DNA 損傷。DNA 促旋酶基因由 GyrA 和 GyrB 兩個(gè)亞基構成， Hp DNA 促旋酶基因突變，尤其是 GyrA 基因突變，可阻止氟喹諾酮類(lèi)藥物與酶特異性結合， 從而導致細菌耐藥。研究表明，左氧氟沙星耐藥主要是與喹諾酮耐藥決定區內GyrA 基因 (編碼DNA螺旋酶)Asn-87 和(或) Asp-91 點(diǎn)突變有關(guān)。喹諾酮耐藥決定區中87、88、91、97 密碼子突變，可引起相應編碼蛋白異常，從而導致左氧氟沙星等喹諾酮類(lèi)耐藥。
RNA 聚合酶基因突變使 RNA 聚合酶上的抗菌藥物靶位發(fā)生構象改變，抗菌藥物無(wú)法與酶特異性結合，從而喪失抗菌作用。RNA 聚合酶 Pro 基因編碼的 B 亞基突變是導致Hp對利福平耐藥的主要原因。氧化還原酶作為生物體內氧化還原體系中重要的催化酶，通過(guò)傳遞電子等一系列反應，在細菌的生長(cháng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。部分抗菌藥物如甲硝唑，可從氧化還原反應中搶奪電子而發(fā)揮其抗菌活性，而氧化還原酶相關(guān)基因突變中斷了這一過(guò)程，使 Hp 逃避了抗菌藥物活性導致耐藥。在Hp中，氧化還原酶編碼基因主要包括 rdxA、frxA 以及 fdxB。rdxA 編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( NADPH) 亞硝基還原酶，frxA 編碼 NADPH 黃素氧化還原酶，fdxB 編碼類(lèi)鐵氧體蛋白。其中 rdxA 基因突變是引起 Hp 對甲硝唑耐藥的主要原因，該基因突變使 NADPH亞硝基還原酶活性降低，導致還原硝基的能力下降，不能取得足夠低的氧化還原電位，使甲硝唑無(wú)法還原生成具備殺菌活性的代謝產(chǎn)物。不過(guò)相關(guān)研究顯示，僅存在 rdxA基因突變不足以引起甲硝唑耐藥，還需要其他因素協(xié)同作用。
Hp 作為一種原核生物，其核糖體RNA(rRNA )分為5S rRNA、16S rRNA 以及23S rRNA， Hp 的耐藥性與16S rRNA 和23S rRNA 編碼基因突變有關(guān)。大環(huán)內酯類(lèi)藥物的抗Hp 機制是其與23SrRNA 的V結構域中的肽基轉移酶環(huán)可逆性結合，從而阻止肽鏈的延伸。而細菌 23S rRNA 編碼基因V區的點(diǎn)突變會(huì )使核糖體構象改變，使抗菌藥物與核糖體的親和力減弱，核糖體內肽鏈得以延伸，細菌可完成蛋白質(zhì)合成工作而抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮完全的抗菌作用。Hp 23SrRNA 分子V區肽基轉移酶環(huán)是克拉霉素目標結合位點(diǎn)，克拉霉素耐藥通常由23SrRNA 基因點(diǎn)突變引起，最常見(jiàn)的是 A2143G，其次是A2142G和A2142C，基因點(diǎn)突變可阻止克拉霉素與核糖體亞基結合。
細菌青霉素結合蛋白 ( penicillin-binding proteins，PBPs)是存在于細菌表面的一類(lèi)膜蛋白，參與Hp 細胞壁中肽聚糖的合成，在細菌生長(cháng)、繁殖中發(fā)揮重要作用。通常情況下，阿莫西林與 PBPs 中的多溴聯(lián)苯共價(jià)結合，阻斷肽聚糖的合成，細菌細胞壁發(fā)生缺陷使細菌失去保護屏障而膨脹、破裂，從而發(fā)揮阿莫西林的抗菌作用。PBPs 編碼基因突變使阿莫西林與 PBPs 的親和力減弱而發(fā)生耐藥。
細胞屏障或外排系統發(fā)生改變
1、外膜蛋白( OMPs) 發(fā)生改變
細菌的外膜是革蘭陰性菌細胞壁的特有結構，位于細菌質(zhì)膜(內膜) 和肽聚糖層的外側，包裹著(zhù)整個(gè)細菌，是細菌重要的保護屏障。OMPs 是細菌外膜的主要成分，包括脂蛋白、孔蛋白、鐵調節蛋白、泵蛋白等，在細菌的生命活動(dòng)中起有重要作用。OMPs 不僅可介導 Hp 黏附，是 Hp 感染致病的關(guān)鍵蛋白，而且與Hp 耐藥密不可分。研究表明，Hp受抗菌藥物刺激后，可上調OMPs 基因表達，OMPs 高表達可增強細菌外膜屏障的保護作用，使抗菌藥物的滲透性進(jìn)一步減弱，這是阿莫西林發(fā)生難治性耐藥和克拉霉素耐藥的另一種機制。OMPs 基因HopB 和 HopC 可使阿莫西林發(fā)生難治性耐藥， HopB、HofC以及 OMP31可使克拉霉素發(fā)生耐藥。
2、細菌生物膜的形成
Hp 感染人體后，附著(zhù)于胃黏膜表面進(jìn)行繁殖、分化，并向胞外分泌多糖基質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、核酸以及一些保護性底物，菌體群落在這些胞外基質(zhì)中互相黏附形成細菌聚集體膜狀物，稱(chēng)為細菌生物膜。不同于浮游細菌，形成生物膜結構的菌群對外界惡劣環(huán)境有很強的適應能力，其中包括對抗菌藥物的抵抗防御。研究顯示，有生物膜形成的菌體對抗菌藥物的耐藥性會(huì )增長(cháng)10～1000 倍。這種高水平的耐藥可能與生物膜介導的多種耐藥機制相關(guān)，首先與 OMPs 高表達類(lèi)似，生物膜的形成會(huì )給細菌提供更強的屏障保護作用。且相關(guān)研究表明生物膜的形成會(huì )促進(jìn) OMPs 的改變，進(jìn)一步加強細菌對外界的防御能力。其次，位于生物膜深層的細菌由于缺少營(yíng)養物質(zhì)和氧氣會(huì )處于休眠狀態(tài)。一般情況下，抗菌藥物僅對處于活動(dòng)期的細菌有良好的抑菌、殺菌作用，而位于生物膜深層的休眠期細菌不易被殺滅。再次，細菌生物膜可與外排泵聯(lián)合作用將進(jìn)入生物膜中的抗菌藥物泵出，如克拉霉素。
3、外排泵的參與
細菌的外排泵是位于細胞膜上的一類(lèi)多藥轉運蛋白，可將進(jìn)入菌體的抗菌藥物泵出胞外， 使菌體胞內抗菌藥物濃度降低而發(fā)揮耐藥作用。外排泵系統能參與多種抗菌藥物的泵出如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、四環(huán)素等， 細菌發(fā)生雙重或多重耐藥的概率顯著(zhù)增加。
此外，細菌球形變以及與耐藥相關(guān)的酶分泌等一系列原因也可使細菌逃避抗菌藥物的活性而導致細菌耐藥。球形變是 Hp 耐藥、Hp 長(cháng)期慢性感染以及根除后復發(fā)的重要原因之一。當外界環(huán)境不利于 Hp 的生長(cháng)繁殖時(shí)，如缺少營(yíng)養物質(zhì)或氧氣、pH 值改變、抗菌藥物干預等，螺旋形Hp 會(huì )發(fā)生球形變，成為L(cháng)形 Hp。球形 Hp 以?xún)煞N形式存在：一種已死亡或變性，另一種處于非活動(dòng)期，致病力相對減弱且對抗菌藥物不敏感。而處于非活動(dòng)期的球形 Hp 在抗菌藥物治療期間啟動(dòng)了耐藥逃逸機制，使抗菌藥物的滅菌活性顯著(zhù)減弱。在停用抗菌藥物2～4周后球形 Hp 可恢復原有的形態(tài)和活性。Hp 等分泌的β-內酰胺酶可使 β-內酰胺類(lèi)抗菌藥物(如阿莫西林)失活，這種酶能特異性打開(kāi)β-內酰胺環(huán)，使阿莫西林失去其抗菌活性從而增加耐藥性。
Hp 感染是普遍的全球性疾病，且發(fā)病率具有較大的地域差異。既往經(jīng)典三聯(lián)治療方案的成功根除率逐漸降低，最主要的原因是抗菌藥物耐藥以及治療方案的不規范實(shí)施。大部分抗菌藥物耐藥是 Hp 菌株基因突變所致，導致關(guān)鍵酶表達異常或不表達，抗菌藥物無(wú)法與細菌相互作用，從而未能發(fā)揮殺菌或滅菌效應。所以Hp 治療方案的選擇應基于當地抗菌藥物耐藥情況，必要時(shí)進(jìn)行個(gè)體敏感性測試。同時(shí)，對耐藥機制的深入研究有利于降低根除失敗率，減少耐藥發(fā)生。
參考資料
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[2]陳梅紅,嚴謹,黨旖旎,張國新.幽門(mén)螺桿菌對抗菌藥物耐藥的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué),2019,24(02):115-118.
作者簡(jiǎn)介：
小米蟲(chóng)，藥品質(zhì)量研究工作者，長(cháng)期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗證工作，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證
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