背景介紹

       眾所周知，癌癥治療通常是基于化療藥物和靶向藥物的療法，因此需要藥物細胞毒 性和安全性兩個方面的平衡。然而，即使靶向治療也不總是只針對異常的癌細胞，這些非特異性毒 性會導致治療指數(shù)低和副作用等問題。而選擇性的藥物遞送策略可以最大限度地減少總體脫靶效應。為了實現(xiàn)強效但有毒 藥物的高效遞送，將抗體結合到靶向特定抗原的ADC策略是藥物發(fā)現(xiàn)中新興的模式之一。

       近年來，靶向蛋白降解(TPD)技術，通常被稱為靶向蛋白水解嵌合體(PROTACs)，已被廣泛應用于藥物化學領域，其在針對不可成藥靶點以及克服耐藥性方面具有巨大優(yōu)勢。PROTACs是一種能降解細胞內靶蛋白的異雙功能分子。

       然而，盡管TPD技術實現(xiàn)了不可成藥致病靶蛋白的降解，但正常細胞和癌細胞之間仍然缺乏選擇性，同樣可能會引起脫靶毒 性的問題。此外，PROTAC的物理化學特性通常與較差的DMPK性質和較低的生物利用度有關。因此，作為一種藥物遞送策略，降解劑-抗體偶聯(lián)物DAC可能為TPD領域提供了新的機會。通過DAC策略，降解劑可以特異性地遞送至癌癥相關細胞（圖1）。

       圖1.ADC與DAC

       PROTAC面臨的挑戰(zhàn)

       PROTAC分子有三個部分:靶蛋白配體，E3泛素連接酶配體，以及連接這兩個配體的連接鏈。通常，PROTAC不符合“類藥五規(guī)則”特征，主要結構特征是(i)高分子量(600 - 1000 Da)， (ii)大極性表面積(PSA > 200 Å)， (iii) >5氫鍵供體，(iv) >10氫鍵受體，(v)溶解性差，(vi)滲透性差。由于這些物理化學性質，PROTAC通常具有較差的細胞攝取和生物利用度。

       研究發(fā)現(xiàn)，藥物遞送系統(tǒng)可以顯著改善PROTAC特性，并提高整體細胞滲透性和生物利用度。迄今為止，已經報道了多種方法來遞送具有更高選擇性的藥物，如小分子藥物綴合物(SMDC)、納米載體和ADC等。這些藥物遞送體系有諸多優(yōu)點，例如：

       (i)克服PROTACs較差的生物利用度和DMPK特性

       (ii)避免復雜化學配方策略(iii)提供有效的轉運和改善的吸收限制

       (iv)通過腫瘤特異性和組織特異性的傳遞，這些致病靶蛋白可以在改善的治療窗口中有效降解。

       ADC和DAC

       ADC和DAC的結構組成相似，主要由單克隆抗體、附著位點、連接子和藥物組成（圖2）。只是ADC的載藥通常使用單功能小分子，DAC使用PROTACs。

       圖2. DAC與ADC的組成特征

       研究表明，抗體是有效載荷(如小分子毒素和PROTAC)特異性結合和傳遞的關鍵成分，以殺死和降解靶蛋白。抗體的先決條件是(i)與具有較高腫瘤表達和有限正常細胞表達的明確抗原的特定相互作用;(ii)能夠保持其特性，如穩(wěn)定性、內化能力以及與連接鏈和有效載荷的結合;和(iii)對目標抗原的高度結合特異性。

       連接鏈技術主要分為兩類。第一類是具有三種釋放機制的可切割連接鏈:溶酶體蛋白酶敏感(肽)、酸敏感(腙)和谷胱甘肽敏感(二硫)連接鏈。第二類是不可切割的連接鏈(硫醚和其他)，與可切割的連接鏈相比，不可切割的連接鏈在循環(huán)中表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

       此外，ADC和DAC的最后一個組成成分是有效載荷。ADC通常會釋放小分子毒素，而DAC是為PROTAC和分子膠設計的。同樣的原理也適用于ADC和DAC：選擇性運輸毒素或PROTACs，同時最大限度地減少脫靶效應。

       ADC中的有效載荷具有更強的細胞結合親和力。因此，有效載荷的數(shù)量(DAR，藥物-抗體比)通常是4 - 8或2 - 6，這取決于偶聯(lián)方法。相比之下，DAC所需的DAR高于ADC，因為PROTAC分子通常比ADC毒素具有更弱的效力。由于有效載荷的數(shù)量和連接鏈的化學性質，通常會出現(xiàn)聚集、低療效和藥代動力學問題。

       DAC作用機制

       ADC和DAC的原理基本相同（圖3）。在給藥后，整個DAC應盡可能保持系統(tǒng)穩(wěn)定，以防止PROTACs過早釋放和血液循環(huán)。首先，DAC的抗體部分識別細胞表面的腫瘤相關抗原。其次，DAC -抗體復合物通過受體介導的內吞作用進行內化。在細胞內，復合物與核內體融合并被運送到活化的溶酶體。在蛋白水解和酸性環(huán)境下，復合物連接子被降解，負載物(PROTAC)隨后被釋放到細胞質中。根據(jù)DAC細胞內靶點，可誘導蛋白降解事件的發(fā)生。

       圖3.DAC的作用機制

       DAC研究現(xiàn)狀

       靶向BRD4的 DAC

       研究表明，由于BRD4在癌癥發(fā)展過程中作為轉錄和表觀遺傳調控因子的關鍵作用，引起了人們對新型BRD4降解物以及BRD4抑制劑的高度關注。第一個報道的DAC由一種靶向C型凝集素樣分子-1 (CLL1)的單克隆抗體(mAb)和BRD4降解劑1 GNE-987組成。研究人員通過在BET結合片段上引入二氫吡咯吡啶酮支架，發(fā)現(xiàn)了一種用于急性髓系白血病(AML)的強效BRD4降解物1。盡管化合物1具有BRD4高效降解能力和較強的抗腫瘤細胞增殖作用，但體外和體內不利的DMPK特性影響了進一步的效果。

       由于CLL1抗原在AML細胞表面高度表達，因此在AML異種移植模型中開發(fā)了一種新型靶向CLL1- DAC的方法。研究人員采用“直接二硫”偶聯(lián)策略，使用含有活化的二硫鍵的甲硫磺酰(MTS)基團與CLL1靶向抗體上的6個半胱氨酸殘基(DAR≈6.0)偶聯(lián)，且沒有顯著的聚集問題（圖4）。研究發(fā)現(xiàn)，通過抗體偶聯(lián)策略增強了嵌合降解物，克服了不良降解物的藥代動力學特性。此外，DAC 4的藥代動力學評估顯示了高水平的體內穩(wěn)定性。

       圖4.靶向CLL1的BRD4 DAC的設計

       STEAP1在前列腺癌中高度表達，靶向STEAP1的ADC也被報道在患者來源的前列腺癌模型中具有抗原依賴性的體內療效。Dragovich等人利用化合物2作為BRD4的降解物和一種識別前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP1)細胞表面抗原的抗體。最初，他們通過亞甲基烷氧基氨基甲酸酯部分將2連接到一個組織蛋白酶B可切割的擬肽連接物上，然后將該連接物與一個靶向SETAP1的單抗結合，以產生DAC 5a (DAR≈2.0)。

       遺憾的是，與降解物2相比，DAC 5a表現(xiàn)出較差的BRD4降解。此外，靶向CLL1的對照偶聯(lián)物5b顯示BRD4降解類似于5a。然而，通過進一步的“高DAR”策略得到了DAC 5c (DAR≈6.0)，與5a相比，DAC 5c的BRD4降解效果有所改善（圖5）。然而，也有研究表明，連接更多的降解劑（高DAR）并不是開發(fā)更有效的DAC的方法。

       圖5. 靶向STEAP1 的BRD4 DAC的設計

       2020年，Maneiro等人報道了HER2依賴的BRD4降解的DAC。研究人員將降解物3 (ARV-771)偶聯(lián)到靶向HER22的曲妥珠單抗(赫賽汀)。與此前DAC制備方法略有不同，他們利用無銅催化的疊氮-炔環(huán)環(huán)加成反應(SPAAC)將 PROTAC 3a與單克隆抗體連接而成，得到了一種新的DAC 12（DAR為4）。研究發(fā)現(xiàn)，DAC 12具有較好的穩(wěn)定性，在HER2+細胞中顯示出選擇性降解BRD4蛋白（圖6）。

       圖6.靶向HER2的BRD4 DAC的設計

       靶向Erα DAC

       除了靶向BRD4的DAC, Dragovich等人還報道了兩種不同的er α靶向降解物13和15。降解劑13由選擇性雌激素受體調節(jié)劑他莫西芬與連接酶配體XIAP組成，并顯示出強大的降解Erα效果。

       研究人員以他莫西芬的羥基為連接位點，使用纈氨酸-瓜氨酸-對氨基芐氧基連接鏈與HER2 單克隆抗體結合的他莫西芬羥基位點，得到了降解劑14（圖7），并成功地證明了目標蛋白的降解。

       圖7.靶向HER2的Erα DAC

       研究人員進一步用基于VHL配體的PROTAC 15，合成了新型的靶向HER2的Erα DAC。研究人員選用VHL的羥基為連接位點，將碳酸基二硫連接劑和焦磷酸二酯基連接劑應用于相應的DAC 16和17（圖8）。然而，這些降解物表現(xiàn)出中等的穩(wěn)定性，需要進一步優(yōu)化提高穩(wěn)定性。

       圖8.基于VHL配體的靶向HER2的Erα DAC

       靶向BRM的DAC

       BRM蛋白，也被稱為SMARCA2，在包括癌癥在內的各種人類疾病中被廣泛發(fā)現(xiàn)。降解物20最初由Arvinas和Genentech于2019年開發(fā)，是BRM的選擇性降解劑。后來，Genentech進一步開發(fā)了一個基于降解物20的DAC 21，主要通過使用二硫基連接鏈將降解物20和選擇性結合CD22細胞表面受體的單抗進行共價連接（圖9）。此外，后續(xù)異種腫瘤移植實驗證明DAC 21可以實現(xiàn)BRM蛋白的高效降解和細胞抗原依賴性降解。

       圖9. BRM的DAC 21的設計

       小                  結

       靶向蛋白降解技術作為一種新的研究策略，已顯示出極大的臨床潛力。然而，由于它們固有的理化特性，往往造成了較差的體內外效果。為了克服這些挑戰(zhàn)，研究人員設計了不同的藥物遞送系統(tǒng)。

       降解物-抗體DAC策略為PROTAC分子提供了更好的特性，如溶解度、細胞內積累、位點特異性分布和減少副作用。因此，DAC是藥物化學中最有前途的新模式之一。但DAC仍有改進的空間，如提高靶點選擇性和驗證連接鏈和降解物與抗體之間的位置等。總而言之，這種DAC的藥物模式大大克服了PROTAC所面臨的各種問題，有望成為一種治療多種人類疾病的候選藥物。

       參考文獻

       1、Degrader?Antibody Conjugates: Emerging New Modality. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01791

       2、Ligand-Targeted Therapeutics in Anticancer Therapy. Nature Reviews: Cancer 2002, 2, 750?763.

       3、Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy. Pharmacol. Rev. 2016, 68, 3?19

       4、Strategies and Challenges for the Next Generation of Antibody?Drug Conjugates.Nat. Rev. Drug Discovery 2017, 16, 315?337.

       5、Folate-Targeted Therapies for Cancer. J. Med. Chem. 2010, 53, 6811?6824.