PART.
01
背景介紹
人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是由肝實質細胞合成并釋放到血液中的一種蛋白質，占血漿總蛋白40%-60%。因為具有良好的血清穩(wěn)定性和半衰期，擁有多個配體結合位點、可逆結合藥物等特點，因此HSA一直被認為是一種天然藥物載體蛋白，可以延長血漿中藥物半衰期[1]。例如，HSA與胰島素類似物Levemir®，胰高血糖素樣1型（GLP-1）激動劑Victoza®等藥物的可逆結合，有效延長了這些藥物對糖尿病的治療效果[2]。同時作為一種替代策略，長效藥物納米顆粒白蛋白結合紫杉醇（Abraxane®）也已被批準用于癌癥臨床治療[3]；利用與HSA基因融合方法， GLP-1受體激動劑Albiglutide已被批準在包括歐盟和美國在內的多個地區(qū)治療II型糖尿病[4]。自然狀態(tài)下藥物與白蛋白的結合效率并不高。藥物通過抗體與白蛋白的非共價結合，或通過基因結構域融合等方法在一定程度上延長了藥物在體內的半衰期、增加了藥物負載和療效（圖1A）。
FcRn（neonatal Fc receptor）是位于細胞膜表面的IgG受體，最初被發(fā)現(xiàn)參與新生兒通過胎盤從母體獲得被動免疫。FcRn的蛋白結構與MHC-I 分子類似，是由α鏈和β2微球蛋白非共價結合組成的異二聚體，在體內多種組織上皮細胞、內皮細胞及多種免疫細胞中廣泛表達[5]。FcRn可與IgG抗體的Fc結構域結合，可阻止IgG分子被溶酶體降解。其內在機制為FcRn與IgG的結合具有pH依賴性。血管內皮細胞通過內吞作用，將血清中的IgG攝入細胞內，IgG與FcRn在酸化的內體（endosome，pH6.0-6.5）中高效結合，并跟隨FcRn轉運至細胞膜表面。在中性（pH7.0-7.5）或微堿性（pH7.35-7.45）的細胞外血液中，IgG與FcRn發(fā)生解離，重新被釋放回血液循環(huán)中，因此FcRn與IgG在不同pH環(huán)境下的結合與解離能力可影響血清中IgG抗體的半衰期[6]。通過對抗體Fc結構域進行位點特異性突變，可以改善IgG分子在體內的藥物動力學和藥效特性。但是過度延長IgG藥物的半衰期也容易通過補體、FcR等途徑過度激活人的天然免疫系統(tǒng)，導致臨床效果并不理想。另外過多的突變位點也可影響抗體Fc結構域的穩(wěn)定性及免疫原性。
白蛋白介導的藥物半衰期在某種程度上依賴于與內源性FcRn的相互作用。研究顯示，F(xiàn)cRn同樣可結合白蛋白。在平衡條件下，F(xiàn)cRn與IgG以2:1的比例結合，白蛋白的其他位點與FcRn以1:1的比例結合，F(xiàn)cRn對白蛋白的內在保護機制與IgG 類似，同樣以pH依賴的方式將白蛋白釋放回血液中參與體內循環(huán)（圖1 B C），而且這種結合本質上是疏水的[7]。FcRn的存在極大延長了白蛋白在血漿中的半衰期[1]。通過調節(jié)FcRn與白蛋白的條件性結合已經逐漸成為一種極具吸引力的藥物傳遞技術。多種藥物通過直接與Fc/HSA進行融合或耦聯(lián)、或通過改造Fc/HSA與FcRn的結合力度，在一定程度上延長了藥物在血清中的半衰期和藥效[8]。但是通過小鼠模型來研究發(fā)現(xiàn)，HAS和MSA（小鼠血漿白蛋白）跟鼠FcRn存在競爭性結合，導致HSA與鼠FcRn之間的相互作用很弱，HSA的半衰期并未得到有效改善[9]。因為單人源化HSA的小鼠模型并不利于臨床前研究。所以雙人源化的FcRn與Albumin嚙齒動物模型對于模擬人體生理狀態(tài)藥物代謝及長效藥物開發(fā)顯得尤為重要。
圖1. 血清白蛋白依賴的長效藥物機理
PART.
02
FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型
與白蛋白相關長效抗腫瘤藥物開發(fā)
為了支持血清白蛋白（HSA）介導的長效藥物研發(fā)，未來模式已經成功開發(fā)了FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型。該模型的設計旨在模擬HSA與FcRn在人體內的表達和代謝模式，為藥物研發(fā)提供了重要的實驗平臺。具體來說，圖2展示了FcRn基因人源化策略和表達驗證結果。Western雜交實驗結果表明，人FcRn在肝臟組織中得到了穩(wěn)定的表達，而在野生型小鼠中沒有檢測到人FcRn的表達。同時，圖3還展示了Albumin基因人源化策略和表達驗證結果，Elisa實驗結果表明，在小鼠血清中，HAS表現(xiàn)出接近生理水平的表達。
圖2. FcRn基因的人源化及其在肝臟的表達
圖3. Albumin基因人源化及其在小鼠血清的表達
這一雙人源化小鼠模型在白蛋白相關長效抗腫瘤藥物的開發(fā)中具有重要意義。在藥物研發(fā)中，一種常見的策略是使用雙特異抗體分子，這些分子可以特異性地結合兩個不同的抗原分子。尤其對于靶向CD3T細胞和腫瘤細胞的雙特異抗體分子，由于其容易引發(fā)Fc介導的細胞毒性，研究人員開始探索不包含F(xiàn)c部分的CD3雙特異抗體分子[10]。IMB45400是某公司開發(fā)的無Fc端雙特異抗體分子。然而，該分子在體內半衰期較短。為了解決這一問題，研究人員開發(fā)了可以共價結合HSA的CD3雙特異抗體分子(IMB454001)。在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體內，IMB454001的半衰期比IMB45400提高了11倍。這種結合了HSA的雙特異分子提高了藥物的安全性，同時改善了其體內藥理動力學表現(xiàn)，如圖4所示。
圖4. 通過與HSA結合提高CD3雙特異抗體藥物在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體體內藥物動力學
類似的設計策略也可以應用于其他重組蛋白藥物，例如，納米抗體和細胞因子的分子量比較小，其自身可以被工程化以改善其藥代動力學。通過與HSA的融合或者增強與HAS的親和有助于提高這些分子的穩(wěn)定性，降低在體內的降解速率，從而延長它們的半衰期，提高藥物效果。與Fc融合蛋白相比，HSA結合蛋白藥物在提高藥物安全性方面具有優(yōu)勢，因為Fc部分可能引發(fā)不需要的免疫反應。同時，HSA還可以用于將多個藥物或分子結合到一個載體中，實現(xiàn)多功能性藥物特性，從而增強治療效果。
在細胞基因治療（CGT）方向，許多藥物也可以通過與HSA的結合來延長其半衰期。外泌體（extracellular vesicles，EVs）是一類細胞分泌的小型膜囊泡，包含蛋白質、核酸、脂質和其他生物分子，對細胞間通信、疾病傳播和免疫調節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。例如，某些公司通過基因改造外泌體，使其具有高度親和HSA的特性，從而顯著延長其在體內的藥物動力學，增加了藥效，如圖5所示。這種策略有助于改善外泌體作為一種藥物輸送工具的性能，增加了外泌體在藥物輸送中的應用前景。
圖5. 基因工程改造的外泌體及其在FcRn/Albumin雙人源化小鼠體內的藥代研究
此外，HSA還可以應用于小核酸藥物的研發(fā)，這類藥物包括siRNA（小干擾RNA）和miRNA（微小RNA）。它們在肝臟疾病治療中廣泛應用，尤其是在遺傳性肝病和病毒感染方面。然而，siRNA的藥物動力學需要改進，以確保它們能夠準確地作用于目標細胞而不被迅速代謝和排泄。例如，通過適配體(aptamer)可以增加HAS和小核酸藥物之間的親和力，從而增強HSA對siRNA的保護作用，如圖6[11]。這個領域的研究和開發(fā)是不斷發(fā)展前進的，已經有一些創(chuàng)新藥物問世。Inclisiran是一種用于控制膽固醇水平的siRNA藥物，被設計為通過HSA在體內輸送，以減少LDL膽固醇水平。Miravirsen是一種miRNA抗體藥物，用于治療丙型肝炎病毒（HCV）感染，它被設計為與HSA結合，提高了藥物的穩(wěn)定性并延長在體內的生命周期。Nusinersen是用于治療脊髓肌肉萎縮癥的藥物，是一種修飾的小干擾RNA，與HSA結合以延長在體內的藥物效應。
圖6. 通過適配體(aptamer)可以增加ssRNA的藥物動力學
這些藥物的應用領域各不相同，但它們共同利用了HSA的長效性質，以提高藥物的療效和/或降低副作用。此外，該領域仍在不斷發(fā)展，可能還有其他HSA相關的長效藥物在臨床中開發(fā)。
為了便于研究這些藥物在人免疫系統(tǒng)和腫瘤相互作用中的藥效，未來模式還將雙人源化小鼠與免疫缺陷小鼠NV-NSG進行交配。這一交配策略的目的是創(chuàng)建具有免疫缺陷但同時具備HSA介導的長效藥物代謝的小鼠模型，以更準確地模擬藥物在人體內的表現(xiàn)。通過將雙人源化小鼠與NV-NSG小鼠進行交叉，研究人員可以獲得同時具備FcRn/Albumin雙人源化和免疫缺陷特征的模型。這種模型使研究人員能夠更好地理解藥物在免疫受體上的相互作用，以及其在人源免疫環(huán)境中的藥效。這對于抗腫瘤藥物的開發(fā)和評估具有重要意義，因為藥物在免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞之間的相互作用對其療效產生重要影響。
總之，HSA及FcRn/Albumin雙人源化小鼠模型在白蛋白相關長效抗腫瘤藥物以及小核酸藥物的研發(fā)中具有關鍵作用。這一模型提供了寶貴的工具，可用于研究和優(yōu)化不同類型的長效藥物，從而有望提高藥物的療效，延長藥物在體內的生命周期，并增加治療的成功率。
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