嵌合性抗原受體（Chimeric antigen receptor，CAR）是一種人工合成的免疫受體，整合了抗體的抗原識(shí)別區(qū)，T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的信號(hào)區(qū)，以及共刺激分子的信號(hào)區(qū)。利用基因工程方法在T細(xì)胞中外源表達(dá)CAR后，產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞可以針對(duì)特定抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。CAR-T細(xì)胞治療已經(jīng)獲批用于治療腫瘤，在自身免疫病中也展示了很好的應(yīng)用前景，未來(lái)還可以用于感染、器官纖維化、衰老等多種場(chǎng)景。

       與天然的受體TCR相比，CAR的抗原敏感性差，并且與其它信號(hào)分子的協(xié)同性差。這些劣勢(shì)是因?yàn)镃AR無(wú)法像TCR一樣形成成熟的免疫突觸來(lái)整合各條信號(hào)通路。這些信號(hào)的劣勢(shì)會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞無(wú)法清除抗原表達(dá)量低的靶細(xì)胞，并且容易發(fā)生功能耗竭，難以長(zhǎng)期工作。優(yōu)化CAR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能是突破目前CAR-T細(xì)胞治療臨床瓶頸的關(guān)鍵所在。

       2024年11月27日，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）許琛琦研究組聯(lián)合上海科技大學(xué)王皞鵬研究組，在 Immunity 期刊發(fā)表了題為：Phase separation of chimeric antigen receptor promotes immunological synapse maturation and persistent cytotoxicity 的研究論文。

       該研究在傳統(tǒng)二代CAR分子胞內(nèi)段引入TCR中的CD3ε元件（E-CAR），并且對(duì)CD3ε進(jìn)行了序列優(yōu)化，提高E-CAR在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。E-CAR分子可以通過(guò)cation-pi相互作用產(chǎn)生液液相分離（LLPS），幫助免疫突觸的形成與成熟；這不僅增強(qiáng)了E-CAR分子本身的信號(hào)功能，也能招募CD2等共刺激分子，更好地利用內(nèi)源共刺激信號(hào)。E-CAR-T細(xì)胞比普通的CAR-T細(xì)胞具有更高的抗原敏感性，以及更好的持續(xù)殺傷能力，在初發(fā)腫瘤和復(fù)發(fā)腫瘤的動(dòng)物模型中，展示了更好的抗腫瘤功能。目前E-CAR已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，展示了很好的應(yīng)用前景。

可相分離的E-CAR促進(jìn)T細(xì)胞免疫突觸成熟，從而提高抗原敏感性和細(xì)胞長(zhǎng)效性

       大多數(shù)T細(xì)胞的TCR主要由抗原識(shí)別亞基TCRαβ和信號(hào)傳遞亞基CD3εδ、CD3εγ、CD3ζζ組成。CD3分子富含多處功能序列，可以結(jié)合不同信號(hào)分子，發(fā)揮各種調(diào)控功能。其中，CD3ε分子的N端是一段堿性氨基酸富集區(qū)（Basic amino acid-rich sequence，BRS），緊接著是一段脯氨酸富集區(qū)（Proline-rich sequence，PRS），C 端則由一段包含RK序列的免疫受體酪氨酸激活基序（Immunoreceptor activation tyrosine-based motif，ITAM）組成。

       許琛琦團(tuán)隊(duì)和合作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)T細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，BRS與細(xì)胞質(zhì)膜的酸性磷脂發(fā)生靜電相互作用，將CD3e的胞內(nèi)區(qū)屏蔽在膜內(nèi)，防止T細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的基底信號(hào)（Xu et al., Cell 2008）；抗原刺激TCR后，鈣離子大量?jī)?nèi)流，中和酸性磷脂的負(fù)電荷，從而打破BRS和酸性磷脂的靜電相互作用，釋放CD3ε胞內(nèi)區(qū)（Shi et al., Nature 2013）；CD3ε BRS隨后和酪氨酸激酶LCK發(fā)生靜電相互作用，促進(jìn)TCR-LCK的液液相分離，增強(qiáng)TCR的磷酸化，并進(jìn)一步促進(jìn)LCK的活化（Chen et al., PNAS 2023）。磷酸化的CD3ε ITAM可以招募抑制性激酶CSK，抑制LCK活性，并打破TCR-LCK相分離，使得TCR信號(hào)回歸基線，防止細(xì)胞過(guò)度活化（Wu et al., Cell 2020）。

       許琛琦團(tuán)隊(duì)進(jìn)而將CD3ε引入二代CAR分子，設(shè)計(jì)了功能上更加模擬TCR的第一代E-CAR。在該論文中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，E-CAR 1.0的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)自己就能夠形成液液相分離，而傳統(tǒng)二代CAR分子的相分離現(xiàn)象較弱。這種相分離主要由CD3ε的堿性氨基酸和其它信號(hào)區(qū)上的酪氨酸所帶的pi電子形成的cation-pi相互作用所介導(dǎo)。在細(xì)胞水平，E-CAR 1.0更易于在細(xì)胞表面聚集，然而E-CAR在膜上的表達(dá)水平比傳統(tǒng)CAR低。因此，團(tuán)隊(duì)通過(guò)蛋白序列優(yōu)化，構(gòu)建了一種E-CAR 2.0版本（B6I），保留了其相分離所需的堿性氨基酸，并有效地提高了膜表達(dá)水平。

28Z CAR、E-CAR 1.0、E-CAR 2.0模式圖

       T細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸時(shí)形成高度有序的超分子激活簇（Supramolecular activation cluster，SMAC），成熟的TCR免疫突觸通常是具有“牛眼“樣結(jié)構(gòu)，由TCR形成的central SMAC（cSMAC），由黏附分子LFA-1形成的peripheral SMAC（pSMAC）和富含磷酸酶CD45的distal SMAC（dSMAC）。pSMAC和dSMAC之間還有共刺激受體CD2形成的花冠結(jié)構(gòu)，富含CD28、ICOS等多種共刺激分子和PD-1等共抑制受體，共同調(diào)控T細(xì)胞信號(hào)。多層有序的免疫突觸結(jié)構(gòu)確保了信號(hào)的有效傳遞。很多研究表明CAR分子不能形成經(jīng)典的免疫突觸結(jié)構(gòu)，CAR分子形成的通常是不規(guī)則的微簇結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致其對(duì)抗原信號(hào)傳遞低效和對(duì)共刺激信號(hào)利用不足。與TCR相比，傳統(tǒng)CAR分子只利用了CD3ζ鏈作為其主要信號(hào)傳遞亞基。其余CD3鏈的缺失可能導(dǎo)致CAR無(wú)法形成成熟的免疫突觸。

       由于抗原受體聚集是免疫突觸形成的基礎(chǔ)，E-CAR相分離促進(jìn)了免疫突觸成熟，不僅提升了E-CAR在cSMAC中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，還在外周形成更好的CD2花冠結(jié)構(gòu)，招募PI3K這些信號(hào)分子來(lái)介導(dǎo)共刺激信號(hào)。團(tuán)隊(duì)還注意到，E-CAR免疫突觸呈現(xiàn)出信號(hào)先放大后減弱的動(dòng)態(tài)性，與TCR形成的免疫突觸非常相似。

       團(tuán)隊(duì)接下來(lái)研究了E-CAR-T細(xì)胞的功能，發(fā)現(xiàn)其對(duì)弱抗原腫瘤細(xì)胞的結(jié)合與殺傷都更強(qiáng)。通過(guò)建立腫瘤細(xì)胞反復(fù)刺激模型，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)E-CAR-T細(xì)胞的長(zhǎng)效殺傷效果更好，在清除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還可維持自我增殖。RNA測(cè)序結(jié)果顯示E-CAR-T細(xì)胞可以利用CD2信號(hào)來(lái)緩解功能耗竭，這與其能誘導(dǎo)形成CD2花冠結(jié)構(gòu)這一現(xiàn)象吻合。在血液瘤和實(shí)體瘤的初發(fā)腫瘤動(dòng)物模型以及血液瘤復(fù)發(fā)的動(dòng)物模型中，E-CAR-T細(xì)胞都比傳統(tǒng)的細(xì)胞表現(xiàn)出了更好的抗腫瘤效果。

       綜上所述，該研究通過(guò)蛋白設(shè)計(jì)，構(gòu)建了可相分離的新型E-CAR分子，提高了免疫突觸質(zhì)量，從而提高了抗原敏感性和細(xì)胞持續(xù)性，在動(dòng)物模型中取得了很好的疾病治療效果。

E-CAR胞內(nèi)段相分離就像睡蓮的根莖交錯(cuò)纏繞，吸引來(lái)的各種小魚(yú)意味著成熟的免疫突觸招募了各類(lèi)下游信號(hào)分子，介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)

       中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心許琛琦研究員和上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬研究員為論文共同通訊作者。分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士研究生徐心怡、上海科技大學(xué)與分子細(xì)胞中心聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生陳昊天、分子細(xì)胞中心博士研究生任正旭、國(guó)科大杭州高等研究院碩士研究生徐曉敏為論文共同第一作者。