睡眠是動物體內由晝夜節(jié)律和穩(wěn)態(tài)過程共同調節(jié)的一項重要生理活動。在果蠅、小鼠、狗和人類身上采用的遺傳學方法已被證明在揭示調控睡眠的基因方面十分有效。例如，包括在維持清醒方面發(fā)現的食欲素（也叫做下丘腦泌素）及其受體，以及在調節(jié)睡眠方面發(fā)現的鹽誘導激酶 3（SIK3）。
由于睡眠只能在動物身上進行測量，而無法在分子層面進行，因此該領域的研究人員都依靠電生理學和遺傳學來開啟果蠅和小鼠睡眠分子及機制的研究。
2024年12月30日，饒毅教授團隊在 Cell 子刊 Cell Chemical Biology 上發(fā)表了題為：Calcineurin: An essential regulator of sleep revealed by biochemical, chemical biological, and genetic approaches 的研究論文。
該研究以對睡眠至關重要的激酶的磷酸化位點為靶點，采用生物化學和化學生物學方法，發(fā)現鹽誘導激酶 3（SIK3）第 469 位蘇氨酸被丙氨酸取代（T469A）的小鼠的睡眠時間增加。鈣調神經磷酸酶（CaN）在體外和體內均可使 SIK3 的 T469 和 S551 位點去磷酸化，但 T221 位點不受影響。敲除 CaN 的調節(jié)亞基 PPP3R1，可使小鼠每天的睡眠時間減少超過 5 小時，這超過了所有已知的基因突變對小鼠睡眠時間的改變。
該研究揭示了鈣調神經磷酸酶（CaN）在睡眠中具有關鍵的生理作用，并開創(chuàng)了生化純化和化學生物學作為研究睡眠的有效方法。
對睡眠機制的研究傳統(tǒng)上依賴于電生理學和遺傳學。由于只能通過行為觀察和物理手段來測量整個動物的睡眠，因此沒有通過生化和化學生物學方法來開展睡眠研究。
在評估了這些策略的優(yōu)勢和局限性之后，饒毅團隊決定嘗試兩種方法：一種是采用經典純化方法的生化方法，另一種是采用化學生物學方法的化學生物學方法。研究團隊的首個靶標底物是 SIK3，此前筑波大學的柳澤正史團隊以及饒毅團隊已經發(fā)現其位點特異性磷酸化對睡眠調節(jié)十分重要。
由于SIK3中特定的磷酸化位點能夠指示睡眠需求并參與睡眠調節(jié)，研究團隊以該蛋白作為底物，通過生物化學方法鑒定其調控因子，然后測試這些體外磷酸化的生化調控因子是否也能調控動物的睡眠。
蛋白質磷酸化在不同的睡眠-覺醒相關狀態(tài)下有所不同。哺乳動物的睡眠被認為與 PKA、ERK、AMPK、CaMKIIα、CaMKIIβ、JNK、SIK3、SIK1、SIK2，以及 LKB1 有關。CaMK2b 基因敲除小鼠每天的睡眠時間減少超過 2小時，多于其他已知基因突變。
關于哺乳動物睡眠中的蛋白磷酸酶（PPase），目前仍知之甚少。20 世紀 70 年代發(fā)現的一種蛋白質Calcineurin（CaN），直到 80 年代才確定其作為磷酸酶的功能。CaN（鈣調神經磷酸酶）是唯一一種由鈣離子（Ca2+）和鈣調蛋白（CaM）激活的磷酸酶，它是一種二聚體，由催化亞基鈣調神經磷酸酶A（PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3CC）和調節(jié)亞基鈣調神經磷酸酶B（PPP3R1 或 PPP3R2）組成。PPP3CA、PPP3CB 和 PPP3R1 在體內普遍表達，而 PPP3CC 和 PPP3R2 在睪丸中發(fā)揮重要作用。PPP3CA 是大腦中含量最豐富的催化亞基，而 PPP3R1 則是含量最豐富的調節(jié)亞基。
在確定 SIK3 中一個特定磷酸化位點：蘇氨酸（T）469的重要性后，研究團隊開始尋找 SIK3 的蛋白磷酸酶（PPase）。雖然SIK1和SIK2中絲氨酸（S）551等效位點的缺失導致了與 SIK3 中 S551 位點功能增益相同的表型，但研究團隊發(fā)現，Sik1 或 Sik2 基因的缺失并不影響小鼠的睡眠。因此，研究團隊重點關注 Sik3 基因。
SIK3 在 T469 和 S551 位點的 PKA 磷酸化增加了 SIK3 與 14-3-3 蛋白的相互作用。14-3-3 蛋白結合抑制 SIK3，而 T469 或 S551 的缺失增加了 SIK3 信號傳導。T469 的磷酸化的功能意義未知。
在這項最新研究中，研究團隊構建了 SIK3 第 469 位的蘇氨酸到丙氨酸突變（T469A），并發(fā)現 T469A 小鼠的睡眠增加。
我們采用了兩種方法來尋找 SIK3 的 T469 和 S551 位點的蛋白磷酸酶（PPase）：一種是經典的生物化學方法，即從人 HEK293T 細胞中純化 T469 和 S551 的蛋白磷酸酶；另一種是化學生物學方法，即在小鼠腦中對與 SIK3 相互作用的蛋白質進行光交聯(lián)。這兩種方法都發(fā)現了 PPP3CA ——鈣調神經磷酸酶（CaN）的催化亞基。
體外實驗表明，在存在鈣離子（Ca2+）、鈣調蛋白（CaM）和 PPP3R1 的情況下，PPP3CA 能夠使磷酸化的 T469 和 S551 去磷酸化。PPP3CA 無法使磷酸化的 T221 位點去磷酸化，而該位點的磷酸化可促進 SIK3 的活性，以提示睡眠需求并促進睡眠。
在敲低 PPP3CA、PPP3CB 或 PPP3R1 的 HEK293T 細胞中，Ca2+ 離子載體誘導的 T469 和 S551 位點的去磷酸化受到抑制，但 T221 位點的去磷酸化未受影響。當敲低 PPP3CA 或 PPP3R1 時，T469 和 S551 位點的磷酸化在小鼠腦內增加，而 T221 沒有增加。PPP3CA 敲低的小鼠，每天睡眠時間減少了大約3小時，PPP3R1 敲低的小鼠，每天睡眠時間減少超過 5 小時，這超過了所有已知基因突變導致的小鼠睡眠變化。
通過測量睡眠變化的程度，鈣調神經磷酸酶（CaN）成為目前發(fā)現的最重要的睡眠調控因子。研究團隊表示，該研究成功發(fā)現了對睡眠至關重要的分子，顯示了生物化學和化學生物學（以及遺傳學）在睡眠研究方面的驚人力量。
論文鏈接：https://www.cell.com/cell-chemical-biology/abstract/S2451-9456(24)00513-0
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