予路乾行聯(lián)合北京大學(xué)藥學(xué)院、武漢理工大學(xué)等頂尖研究團隊的研究成果《Systematic evolution of functional oligonucleotides for targeted protein degradation》已于2025年2月在線發(fā)表于《Chem》期刊（Cell子刊）。該研究由張力勤教授團隊創(chuàng)新性提出了一種系統(tǒng)進化平臺，能高效生成特異性適配體降解劑，利用E3連接酶CRBN和VHL兩種E3連接酶的測試中成功降解了BRD4和IRAK4蛋白，解決了靶向分子選擇和連接子優(yōu)化的技術(shù)難題。與此同時，團隊開發(fā)了雙特異性RNA適體降解劑，展示了該平臺的廣泛適用性。予路乾行團隊結(jié)合分子動力學(xué)模擬等技術(shù)，驗證了靶向BRD4降解劑PA2的可行性，為新型蛋白降解劑的開發(fā)提供了強有力的支持。

研究亮點1：系統(tǒng)性進化平臺

在BRD4降解適配體的設(shè)計過程中，建立隨機DNA文庫并進行3'端化學(xué)修飾，以連接E3連接酶配體，團隊成功設(shè)計出具有高度特異性的aptamer降解劑。借助微珠展示技術(shù)，DNA適配體被固定在微珠表面，與BRD4靶標(biāo)蛋白、E3連接酶CRBN及熒光標(biāo)記的泛素化體系共同孵育，從而篩選出能夠有效促進BRD4泛素化的適配體。進一步使用流式細胞分選（FACS）技術(shù)，團隊從中篩選出雙熒光信號最強的適配體，并對其進行擴增與優(yōu)化。在優(yōu)化過程中，團隊引入了炔基修飾的dU（EdU）以增強適配體與E3配體的結(jié)合力，并通過點擊化學(xué)偶聯(lián)CRBN配體pomalidomide，顯著提升了招募E3連接酶的能力。最終，篩選出的PA2適配體表現(xiàn)出5.3 nM的高親和力，并在HEK293T細胞中實現(xiàn)了87%的BRD4降解，IC50為58.9 nM，顯示出在靶向降解中的卓越性能。

Figure 1. Evolution of aptamer-pomalidomide chimeras inducing BRD4 ubiquitination and proteolysis degradation. (A) Construction of the library for selecting aptamer-pomalidomide chimeras. (B) Systematic functional screening process of aptamer-pomalidomide chimeras for BRD4 ubiquitination. (1) Emulsion PCR creates aptamer particles, each displaying multiple copies of a single sequence. (2) The emulsions are broken, and the aptamer particles are converted to single-stranded DNA via NaOH treatment. (3) Pomalidomide ligands are added to the aptamers. (4) The aptamer chimera particles are incubated with an in vitro UPS system, where each ubiquitin is labeled with a FITC fluorophore and BRD4 is labeled with an APC fluorophore. (5) FACS separates aptamer particles that generate strong dual fluorophore signals (quadrant I of the FACS plot). (6) The aptamers undergo a reverse step to produce natural DNA, which is either used as a template for an additional round of screening or characterized via high-throughput sequencing (7). (C) Sorting of microbeads bearing aptamer chimeras capable of inducing ubiquitination. (D) Characterization of selected aptamer chimeras for BRD4 binding and ubiquitination. Flow cytometry is used for investigating the binding and ubiquitination ability of four aptamer chimera candidates. Microbeads bearing aptamer chimeras are incubated with 100 nM BRD4 in the UPS system. (E) Concentration-dependent degradation of BRD4 by the selected aptamer-pomalidomide chimera compared with VH032 replacement and random sequence replacement. Error bars denote ±SD of the mean for n = 3 independent replicates. The p values were determined by Student’s t test: *p < 0.05, **p < 0.01.

研究亮點2：降解機制的分析

為了深入揭示PA2誘導(dǎo)BRD4泛素化降解的機制，予路乾行團隊結(jié)合分子動力學(xué)模擬（MD）和分子對接技術(shù)（HADDOCK），全面探討了PA2的作用機制。團隊首先利用3dRNA/DNA與MD模擬預(yù)測且優(yōu)化了PA2適配體的三維結(jié)構(gòu)，并借助MOE2022軟件補全BRD4 BD1結(jié)構(gòu)域（PDB ID: 4QB3）中的缺失部分，確保了結(jié)構(gòu)的完整性。在此基礎(chǔ)上，團隊進行了500 ns的MD模擬，探索了PA2適配體在溶液中的動態(tài)構(gòu)象，并進一步優(yōu)化了其與BRD4 BD1的結(jié)合模式，最終獲得了穩(wěn)定的PA2_BD1復(fù)合物構(gòu)象。

接著，團隊使用AlphaFold2預(yù)測了PA2_BRD4體系（E49-E460）的完整構(gòu)象，并通過AMBER22軟件進行空間優(yōu)化和動態(tài)篩選。

BRD4_PA2全序列模擬結(jié)果

在優(yōu)化的基礎(chǔ)上，團隊采用蛋白-蛋白對接技術(shù)，將優(yōu)化后的PA2_BRD4復(fù)合物與CRBN（PDB ID: 8OIZ）進行了對接，篩選出了與CRBN晶體中Pomalidomide疊合效果最佳的53種構(gòu)象。此外，團隊借鑒了Mikhail Ignatov等人的方法，構(gòu)建了完整的BRD4(E49-E460)_PA2_CRBN-DDB1-CUL4A-Rbx1-E2-Ub泛素降解體系（原子數(shù)達百萬級）?？紤]到泛素化反應(yīng)中E2連接酶催化核心半胱氨酸與靶標(biāo)表面暴露的賴氨酸之間的距離需維持在50~60 ?范圍內(nèi)，以促進Ub轉(zhuǎn)移，團隊篩選出了符合該距離要求且無碰撞的構(gòu)象，作為合理的泛素化復(fù)合物體系。基于泛素化過程的動態(tài)特性，團隊通過聚類分析篩選出了12種潛在穩(wěn)定的泛素化體系，并成功驗證了PA2靶向BRD4泛素化降解的分子機制。

Figure S9. Molecular dynamics simulations process

關(guān)于張力勤教授課題組

張力勤老師于2021年回國，加入北京大學(xué)藥學(xué)院并創(chuàng)立功能核酸分子診療實驗室，致力于功能核酸分子體外篩選、蛋白功能調(diào)控、新型核酸藥物開發(fā)、藥物新靶點發(fā)現(xiàn)和疾病診斷監(jiān)測方法等研究。自課題組成立以來，取得了顯著進展。2024年8月，課題組的首篇研究論文《Functional Aptamers In Vitro Evolution for Intranuclear Blockage of RNA-Protein Interaction》在《Journal of the American Chemical Society》上發(fā)表。2024年9月，課題組的工作獲得國家重點研發(fā)計劃項目的支持。2025年初，課題組的最新研究成果《Systematic Evolution of Functional Oligonucleotides for Targeted Protein Degradation》又在《Chem》雜志上發(fā)表，標(biāo)志著團隊在核酸分子診療領(lǐng)域的持續(xù)突破。祝賀這個充滿活力的團隊取得如此輝煌的成就！

關(guān)于予路乾行

予路乾行是一家專注于計算化學(xué)與分子動力學(xué)模擬的創(chuàng)新型生物醫(yī)藥公司。通過結(jié)合最先進的分子模擬和AI技術(shù)，我們?yōu)樾滤幯邪l(fā)提供強有力的計算支持，涵蓋小分子藥物、PROTAC、ADC、抗體、RNA藥物等多種藥物研發(fā)領(lǐng)域。我們的技術(shù)平臺已與博瑞醫(yī)藥、Vial等多家國際制藥公司合作，并助力其在Nature期刊子刊發(fā)表多項成果。我們的目標(biāo)是為全球藥物發(fā)現(xiàn)提供先進的技術(shù)支持，推動生物醫(yī)藥領(lǐng)域的創(chuàng)新發(fā)展。

參考資料

https://doi.org/10.1016/j.chempr.2024.102408
https://www.ebiotrade.com/newsf/2025-2/20250207083337836.htm
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jctc.6b00186
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c08824