要了解單細胞中單個 RNA 分子的多種動態(tài)行為，就需要實時以高分辨率對其進行可視化。然而，目前還沒有能夠以通用的方式實現(xiàn)對未經(jīng)修飾的內(nèi)源性 RNA 進行單分子活細胞成像。
2025年2月18日，諾貝爾化學(xué)獎得主、CRISPR 基因編輯技術(shù)先驅(qū) Jennifer Doudna 教授團隊在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm 的研究論文。
該研究開發(fā)了一種基于 CRISPR–Csm 系統(tǒng)的單分子活細胞熒光原位雜交（smLiveFISH）技術(shù)，能夠直接且高效地在可視化各種細胞類型中的任何未經(jīng)修飾的單個 RNA 分子。利用 smLiveFISH 技術(shù)，研究團隊在活細胞中追蹤單個天然 NOTCH2 和 MAP1B 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄本，并確定了其 mRNA 的不同的定位機制。
RNA 直接參與蛋白質(zhì)合成，并在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。除了 RNA 序列之外，個體轉(zhuǎn)錄本的時空分布也控制著這些活動。事實上，RNA、RNA結(jié)合蛋白（RBP）和其他細胞機制之間的動態(tài)和協(xié)調(diào)的相互作用發(fā)生在特定的亞細胞區(qū)域和時間點。
活細胞 RNA 成像方法已開始揭示單個細胞內(nèi)的 RNA 動態(tài)，彰顯了此類研究的重要價值。然而，基于莖環(huán)結(jié)構(gòu)（Stem Loop）或適體（Aptamer）的標記方法需要在 RNA 特定區(qū)域插入基因序列，或依賴外源表達標記 RNA——這些操作既耗時又可能干擾 RNA 的天然行為。使用分子信標或 CRISPR-Cas 系統(tǒng)實現(xiàn)未修飾內(nèi)源 RNA 可視化的方法，則受限于單分子分辨率不足（通常僅限于高豐度重復(fù) RNA ）以及內(nèi)體滯留探針或過表達熒光蛋白融合體產(chǎn)生的嚴重背景噪聲。
盡管現(xiàn)有方法在特定案例中已獲成功，但開發(fā)通用型單分子水平活細胞原生 RNA 成像平臺的需求日益迫切。
在這項最新研究中，研究團隊開發(fā)了一種單分子活細胞熒光原位雜交（single-molecule live-cell fluorescence in situ hybridization，smLiveFISH）技術(shù)，該技術(shù)利用來自嗜熱鏈球菌的 RNA 靶向的 III-A 型 CRISPR-Csm 系統(tǒng)以及多重向?qū)?RNA，能夠直接且高效地在包括原代細胞在內(nèi)的多種細胞類型中對任何未經(jīng)修飾的單個 RNA 分子進行可視化成像，從而追蹤不同種類活細胞中的單個 mRNA 分子。
smLiveFISH成像天然單個 mRNA 分子的原理
研究團隊利用 smLiveFISH 技術(shù)分析了兩種不同 mRNA（NOTCH2 和 MAP1B）的行為，這兩種 mRNA 分別編碼一種細胞表面受體蛋白和一種微管相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，NOTCH2 的 mRNA 包含兩種具有不同動態(tài)特性的群體，這與共翻譯多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)。相比之下，MAP1B 的 mRNA 表現(xiàn)出幾種不同的行為，包括以不依賴翻譯的方式進行定向運輸。
活細胞中單個 NOTCH2 mRNA 的動態(tài)變化
活細胞中單個 MAP1B mRNA 的動態(tài)變化
研究團隊進一步證明，smLiveFISH 能夠檢測出單個轉(zhuǎn)錄本在對小分子作出反應(yīng)時定位上的差異，例如被整合入 mRNA 處理小體（也叫做 P 小體），這突顯了 smLiveFISH 技術(shù)在評估單個內(nèi)源性 RNA 行為中的實用性。因此，smLiveFISH 技術(shù)有可能揭示健康和疾病狀態(tài)下天然轉(zhuǎn)錄本的時空組織原理。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02540-5
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