摘要：中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞在重組蛋白和單克隆抗體制備中應(yīng)用廣泛，但傳統(tǒng)培養(yǎng)依賴的胎牛血清（FBS）存在諸多問題，因此無血清培養(yǎng)基（SFM）的研發(fā)意義重大。本文系統(tǒng)總結(jié)了 CHO 細(xì)胞的應(yīng)用優(yōu)勢、高密度表達(dá)策略，以及無血清培養(yǎng)基從傳統(tǒng)血清替代物到微生物源物質(zhì)的發(fā)展歷程，并闡述了其作用機(jī)制，旨在為 CHO 細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)提供理論指導(dǎo) 。

一、CHO 細(xì)胞：生物制藥的 “明星細(xì)胞”

CHO 細(xì)胞的發(fā)展歷程：CHO 細(xì)胞自 1957 年被首次分離出來后，就因其具有無限增殖的能力，成為了生物技術(shù)領(lǐng)域的 “寵兒”。1987 年，Genentech 公司首次利用重組 CHO 細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑，開啟了哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在生物制藥領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用 。之后，原始的 CHO 細(xì)胞經(jīng)過不斷馴化和基因工程改造，產(chǎn)生了如 CHO-K1、CHO-DXB11、CHO-DG44 和 CHO-S 等多種常用的細(xì)胞系（CHO 細(xì)胞發(fā)展譜系的圖1，幫助讀者更清晰地了解其發(fā)展脈絡(luò) ）。

應(yīng)用優(yōu)勢顯著：CHO 細(xì)胞之所以在生物制藥中應(yīng)用廣泛，是因為它有很多突出的優(yōu)點 。首先，它具備精準(zhǔn)的翻譯后修飾能力，能產(chǎn)生與人細(xì)胞糖基化類似的重組蛋白，這使得生產(chǎn)出的生物藥活性更高，與人體的相容性更好 。其次，它擁有強(qiáng)大的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，像 DHFR 系統(tǒng)和 GS 系統(tǒng)，能利用外部壓力提高重組蛋白的合成效率 。再者，CHO 細(xì)胞感染病毒的風(fēng)險較低，產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白少，便于目標(biāo)蛋白的純化和分離 。而且，它既能貼壁生長，也能懸浮生長，適合在生物反應(yīng)器中進(jìn)行無血清大規(guī)模培養(yǎng) 。

實現(xiàn)高效生產(chǎn)的策略：盡管 CHO 細(xì)胞有諸多優(yōu)勢，但目前其生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的效率與原核細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比還有提升空間 ?？蒲腥藛T主要從細(xì)胞工程、代謝工程和優(yōu)化培養(yǎng)條件這幾個方面入手，來提高重組蛋白的生產(chǎn)效率 。其中，培養(yǎng)基的優(yōu)化至關(guān)重要 。比如，在氨基酸降解途徑中產(chǎn)生的抑制性副產(chǎn)物會影響細(xì)胞生長，去除這些副產(chǎn)物并添加如迷迭香酸等生物活性化合物，能促進(jìn) CHO 細(xì)胞的增殖 。此外，調(diào)整培養(yǎng)基中的鐵濃度也能提高蛋白產(chǎn)量，但需要注意避免鐵過量導(dǎo)致蛋白變色 。不過，不同實驗室和目標(biāo)產(chǎn)品對培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果差異較大，開發(fā)適合特定細(xì)胞系的新培養(yǎng)基仍是當(dāng)前研究的重點 。

二、無血清培養(yǎng)基：CHO 細(xì)胞培養(yǎng)的新方向

FBS 的局限與無血清培養(yǎng)基的興起：在 CHO 細(xì)胞的傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中，通常需要添加 5% - 20% 的 FBS 來維持細(xì)胞的生長和傳代 。然而，F(xiàn)BS 存在不少問題，它的成分復(fù)雜，不同批次之間存在差異，這會導(dǎo)致培養(yǎng)基的質(zhì)量不穩(wěn)定，影響生物過程的可靠性和穩(wěn)定性 。而且，F(xiàn)BS 還存在潛在的污染風(fēng)險，可能攜帶內(nèi)毒素、支原體、病毒等，并且全球 FBS 供應(yīng)日益短缺，價格也比較昂貴，同時從動物福利的角度考慮，使用 FBS 也面臨著倫理問題 。因此，開發(fā)無血清培養(yǎng)基迫在眉睫 。

血清替代物的多樣探索：為了替代 FBS，研究人員進(jìn)行了大量的探索，開發(fā)出了多種血清替代物（血清替代物發(fā)展的圖2，直觀呈現(xiàn)各類替代物 ）。

人血小板裂解物（HPLs）：HPLs 曾被認(rèn)為是很有潛力的血清替代物，它含有多種生長因子和細(xì)胞因子，能促進(jìn)細(xì)胞增殖 。但 HPLs 存在個體和批次間的差異，成分復(fù)雜且具有異源性，還存在傳播人類血源性病原體的風(fēng)險，并且血液儲備的短缺也限制了它的大規(guī)模應(yīng)用 。

動物源無提取物：這類替代物來源于植物、微生物等非動物源，通過物理或化學(xué)方法提取得到，含有多種營養(yǎng)元素 。像大豆、小麥、棉籽水解物等，添加到無血清培養(yǎng)基中不僅能促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高蛋白產(chǎn)量，還能改善產(chǎn)品質(zhì)量，比如影響抗體的電荷異質(zhì)性和糖基化模式（動物源無提取物應(yīng)用效果的表格 1，呈現(xiàn)具體數(shù)據(jù) ）。不過，它們的成分復(fù)雜，有效成分和作用機(jī)制還不完全清楚，需要進(jìn)一步研究來減少批次間的差異 。

益生菌和后生元：益生菌是一類對宿主有益的微生物，后生元則是益生菌的代謝產(chǎn)物或滅活菌體 。研究發(fā)現(xiàn)，它們對細(xì)胞增殖和重組蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用。比如，乳酸菌的無細(xì)胞上清液（CFS）能刺激細(xì)胞生長和免疫細(xì)胞增殖，其中的一些成分，如蛋白質(zhì)、多糖、短鏈脂肪酸等，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能 。酵母提取物作為常用的益生菌細(xì)胞裂解物，富含營養(yǎng)，能顯著促進(jìn)細(xì)胞生長和重組蛋白表達(dá)，但也可能會引起機(jī)體的不良反應(yīng)，所以需要進(jìn)行安全性評估 。從成本角度來看，許多植物源和微生物源的血清替代物成本較低，但由于來源和加工精度不同，其成本也有所差異（各類血清替代物成本對比的表格 2，讓讀者直觀了解 ）。

化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基（CDM）：CDM 的所有成分都是明確的，不含有動物源蛋白或提取物，具有質(zhì)量穩(wěn)定、批次間一致性好的優(yōu)點，有利于細(xì)胞代謝分析和重組藥物的安全生產(chǎn) 。早期的 F12 培養(yǎng)基是成功的 CDM 例子，但它在支持細(xì)胞高密度生長方面存在不足 。后來，通過將 F12 與 DMEM 按 1:1 混合，并添加激素、生長因子等添加劑，形成了 DMEM/F12 培養(yǎng)基 。隨著技術(shù)發(fā)展，科研人員利用化學(xué)計量分析等方法，不斷優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高細(xì)胞密度、活力和重組蛋白產(chǎn)量。在優(yōu)化過程中，常采用基于實驗設(shè)計（DoE）原則的傳統(tǒng)實驗設(shè)計方法，結(jié)合各種統(tǒng)計方法和人工智能技術(shù)，來確定關(guān)鍵影響因素（統(tǒng)計方法和人工智能在 CDM 優(yōu)化中應(yīng)用的表格 3，呈現(xiàn)具體研究案例 ）。

三、無血清培養(yǎng)基對 CHO 細(xì)胞的作用機(jī)制

調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝：葡萄糖是細(xì)胞能量代謝的重要底物，但在無血清懸浮培養(yǎng)中，它往往是限制因素，需要不斷補(bǔ)充 。一些動物源無提取物可以上調(diào)細(xì)胞能量代謝途徑中的相關(guān)蛋白，加速糖酵解和三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞生長和生物合成提供更多能量 。不過，葡萄糖代謝會產(chǎn)生乳酸，乳酸積累過多會對細(xì)胞有毒害作用 。使用乳糖、果糖等低碳分子糖類作為能量底物，能降低細(xì)胞滲透壓，減少乳酸生成 。此外，像\(Mn^{2+}\)、\(Cu^{2+}\)、\(Zn^{2+}\)等微量元素，在細(xì)胞能量代謝和抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用，它們可以作為酶的輔助因子，參與多種代謝過程 。

促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖：在 CHO 細(xì)胞的分批補(bǔ)料培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡對細(xì)胞生長和提高細(xì)胞特異性生產(chǎn)力很關(guān)鍵 。酵母提取物可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白（Cyc）和周期蛋白依賴性激酶（Cdk）的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在 G0/G1 和 G2/M 期，同時維持培養(yǎng)基中豐富的營養(yǎng)環(huán)境，激活 mTOR 信號通路，促進(jìn)細(xì)胞生長和蛋白合成 。多胺類物質(zhì)，如精胺和腐胺，對 CHO 細(xì)胞的正常生長和增殖也至關(guān)重要，它們可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞對鐵的吸收來發(fā)揮作用 。此外，一些益生菌，如雙歧桿菌的裂解物，能通過激活 Wnt/β - catenin 和 PI3K/Akt/mTOR 信號通路，抑制腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖 。

促進(jìn)重組蛋白合成和分泌：血清替代物和其他化學(xué)補(bǔ)充劑促進(jìn)重組蛋白生產(chǎn)的機(jī)制是多方面的，涉及外源基因從轉(zhuǎn)錄、翻譯到蛋白折疊、組裝和分泌的整個過程 。動物源無提取物可以通過提高細(xì)胞活力和調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，來顯著提高重組蛋白的合成效率 。一些小分子有機(jī)酸，如丁酸、戊酸等，可以通過表觀遺傳修飾激活轉(zhuǎn)錄因子，影響基因表達(dá)和調(diào)控 。翻譯過程中，許多具有生長因子活性的氨基酸和寡肽可以上調(diào) PI3K 和 mTOR 蛋白的表達(dá)，激活 PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進(jìn) RNA 在核糖體上的翻譯和延伸 。此外，酵母提取物中的\(Ca^{2+}\)和富含精氨酸的寡肽可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶結(jié)合，加速蛋白折疊和組裝，促進(jìn)蛋白分泌 。棉籽水解物則可以上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的熱休克蛋白和伴侶蛋白，提高重組蛋白的合成和分泌效率 。

四、總結(jié)與展望

CHO 細(xì)胞在生物制藥領(lǐng)域有著不可替代的地位，而開發(fā)新型無血清培養(yǎng)基是提高其培養(yǎng)性能和重組蛋白產(chǎn)量的關(guān)鍵 。目前的許多血清替代物和 CDM 在提高 CHO 細(xì)胞的整合活細(xì)胞密度（IVCD）和蛋白產(chǎn)量方面表現(xiàn)出色，它們通過改善細(xì)胞能量代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)外源基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白折疊分泌等過程發(fā)揮作用。

隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步以及人們對動物福利和環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，動物源無提取物的開發(fā)和應(yīng)用將獲得更大的推動力。但研究人員仍需不斷探索新型動物源無提取物，優(yōu)化其成分和制備方法，提升性能、降低成本，并確保其安全性和有效性，以滿足生物制藥、細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程和醫(yī)學(xué)診斷等多領(lǐng)域的需求，使其性能更接近甚至超越傳統(tǒng)動物血清，成為理想的血清替代品，為市場帶來更多創(chuàng)新和機(jī)遇。

鑒于益生菌對健康的有益作用已得到廣泛認(rèn)可，探索其作為哺乳動物細(xì)胞血清替代品的潛力具有重要意義。同時，益生菌產(chǎn)生的后生元也展現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞生長和組織修復(fù)的生物活性。因此，需要深入鑒定和表征具有最佳促生長和增產(chǎn)特性的特定益生菌菌株及其代謝產(chǎn)物，明確其作用機(jī)制和活性成分，并通過數(shù)學(xué)統(tǒng)計或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法，制定標(biāo)準(zhǔn)化方案和優(yōu)化配方，將潛在的血清替代物和營養(yǎng)因子融入 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

總體而言，探索包括動物源無提取物和后生元在內(nèi)的更多血清替代物，對于以可持續(xù)且符合生物學(xué)規(guī)律的方式提升 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有巨大潛力。這種創(chuàng)新方法有望在生物制藥、基因治療和細(xì)胞培養(yǎng)肉等多個領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。