在生物制藥的 "江湖" 里，想要精準拿捏哺乳動物細胞的生長節(jié)奏，那可真是堪比 "馴服一匹烈馬"-- 難上加難！不過別慌，我們這次帶來了一套超牛的 "細胞改造秘籍"，要用多層次細胞工程策略，把哺乳動物細胞的生長階段安排得明明白白！

       咱們先給細胞來一場 "死亡抵抗特訓(xùn)"。利用 CRISPR/Cas9 這把 "基因剪刀"，果斷敲除促凋亡蛋白 Bax 和 Bak。這就好比給細胞穿上了 "死亡免疫鎧甲"，大大降低了細胞凋亡的概率，不僅提高了細胞活力，還成功給細胞的 "壽命" 續(xù)費，讓它們能在培養(yǎng)過程中 "超長待機"。

       光有 "抗衰 buff" 可不夠，接下來得給細胞裝個 "加速引擎"。我們整出了一套類似 "油門" 的生長加速系統(tǒng)，基于脫落酸誘導(dǎo)系統(tǒng)，精準調(diào)控 cMYC 基因表達。只要輕輕一踩 "油門"，細胞就像開了掛一樣，瘋狂增殖，細胞密度 "蹭蹭" 往上漲，細胞周期也被我們穩(wěn)穩(wěn)掌控。

       有了 "油門"，自然也得配上 "剎車"。于是，我們又打造了一個基于 BLIMP1 基因的四環(huán)素誘導(dǎo)基因回路，就像汽車的 "剎車踏板"。一旦激活，細胞立馬 "踩剎車"，停止生長，細胞周期也被牢牢阻滯在特定階段。

       最后，終極 "王炸" 來了！我們把 "油門" 和 "剎車" 合二為一，開發(fā)出雙重可控系統(tǒng)。這下，哺乳動物細胞的生長動力學(xué)就像被我們握在手中的提線木偶，想快就快，想停就停，實現(xiàn)了動態(tài)又精準的調(diào)控！

       這項研究堪稱合成生物學(xué)工具和組合細胞工程應(yīng)用的 "神仙打架" 現(xiàn)場，不僅為操縱哺乳動物細胞生長搭建了一個超復(fù)雜的框架，還為生物制藥生產(chǎn)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了一個超獨特的范例，簡直就是科研界的 "六邊形戰(zhàn)士"！

       亮點

•        生物生產(chǎn)界的 "精密儀器"：設(shè)計哺乳動物細胞生長動力學(xué)，讓生物生產(chǎn)精度直接 "拉滿"，誤差？不存在的！
•        基因控制界的 "老司機組合"：利用正交誘導(dǎo)電路，打造生長控制的 "油門和剎車" 系統(tǒng)，細胞生長節(jié)奏由我們說了算！
•        細胞平臺界的 "全能選手"：定制生長階段，產(chǎn)出多功能哺乳動物平臺，生產(chǎn)效率高、結(jié)果超可預(yù)測，生物制藥的未來就靠它了！

       簡介

       在復(fù)雜生物藥物生產(chǎn)的 "C 位"，永遠站著哺乳動物細胞這位 "大佬"，不管是重組單克隆抗體，還是基于病毒載體的產(chǎn)品，都離不開它的 "辛勤勞作"。在典型的生物制藥批次生產(chǎn)中，哺乳動物細胞的生長就像一場 "闖關(guān)游戲"，要經(jīng)歷生長、穩(wěn)定和衰退死亡這些關(guān)卡，每一關(guān)都決定著細胞是 "努力干活生產(chǎn)產(chǎn)品"，還是 "躺平擺爛"。

       控制細胞生長的機制，那叫一個 "盤根錯節(jié)"，外在的營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子，內(nèi)在的細胞周期調(diào)節(jié)劑、應(yīng)激反應(yīng)，各種因素 "你方唱罷我登場"，交織成一張復(fù)雜的大網(wǎng)。盡管現(xiàn)有的生物工藝策略已經(jīng)能在一定程度上調(diào)節(jié)培養(yǎng)階段，但想要精準控制細胞生長動力學(xué)，還是像在迷霧中找路 -- 難啊！

       不過，要是能給細胞裝上一套 "油門和剎車" 系統(tǒng)，實現(xiàn)對生長和穩(wěn)定期的動態(tài)控制，那可就厲害了！就像給汽車發(fā)動機配上了 "黃金搭檔"，操控性直接起飛！而要打造這套系統(tǒng)，關(guān)鍵就在于找到能調(diào)節(jié)細胞周期和代謝關(guān)鍵基因表達的 "神秘鑰匙"。

       在我們之前的研究里，發(fā)現(xiàn)了 cMYC 和 BLIMP1 這兩位 "寶藏選手"。它們就像細胞世界里的 "油門" 和 "剎車"，在 B 細胞和漿細胞的發(fā)育過程中，上演著一場精彩絕倫的 "愛恨情仇"。cMYC 在早期 B 細胞中 "風頭無兩"，掌控著細胞增殖、存活和代謝；而 BLIMP1 一登場，就像給 cMYC 按下了 "暫停鍵"，抑制它及其下游靶標，助力細胞向抗體分泌狀態(tài) "華麗變身"。

       cMYC 要是 "放飛自我" 異位表達，細胞就會瘋狂增殖，細胞周期也變得 "整整齊齊"，活脫脫一副癌細胞的 "囂張模樣"。相反，BLIMP1 要是 "過度發(fā)力" 過表達，細胞就會被 "強制下線"，生長停止，細胞周期停滯在 G1/G0 期。

       但改造細胞生長動力學(xué)可不是一帆風順的，還得小心 "凋亡陷阱"。cMYC 的 "超速增殖" 和 BLIMP1 的 "持續(xù)剎車"，都可能觸發(fā)細胞凋亡的 "警報"。cMYC 高表達會通過上調(diào)促凋亡蛋白或者引發(fā) DNA 損傷反應(yīng)，把細胞往凋亡的 "懸崖" 上推；BLIMP1 也不甘示弱，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活未折疊蛋白反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞走向凋亡。所以，用 cMYC 和 BLIMP1 當 "油門" 和 "剎車"，得像走鋼絲一樣小心翼翼，還得順便改造一下細胞的死亡階段，把潛在的凋亡風險 "扼殺在搖籃里"。

       在本研究中，我們決定 "挑戰(zhàn)極限"，對細胞的對數(shù)增長、穩(wěn)定期和死亡這三個關(guān)鍵階段 "下手"。為此，精心設(shè)計了一套多層次細胞工程策略，用上 CRISPR/Cas9 基因組工程和正交可誘導(dǎo)基因回路，實現(xiàn)對 cMYC 和 BLIMP1 表達的 "花式調(diào)控"。

       一開始，我們先敲除 Bax 和 Bak，打造出抗死亡的哺乳動物細胞平臺。接著，給細胞系 "升級裝備"，讓它能表達 r - 單克隆抗體，再把控制 cMYC 和 BLIMP1 基因表達的回路 "安裝" 到基因組里。最后，開發(fā)出雙重可控系統(tǒng)，實現(xiàn)對細胞生長階段的精準控制，充分展示了基因重新設(shè)計在生物工藝中的巨大潛力！想知道具體的實驗操作和結(jié)果？快到原文里一探究竟吧！

       圖 1.利用 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的敲除 (KO) 技術(shù)構(gòu)建抗死亡哺乳動物細胞。A ) 培養(yǎng)過程中哺乳動物細胞生長階段示意圖。B) 本研究中應(yīng)用的細胞工程和細胞系開發(fā)工作流程。C) Bax (NW_003614570.1) 和 Bak (NW_003614972.1) 基因中外顯子（白色）和內(nèi)含子（黑色）示意圖。靶向 Bax 和 Bak 外顯子 1-3 的gRNA 序列如表 S1所示。D) 對照 CHOK1 (HD)、Bax SKOs (X 1-5 )、Bak SKOs (K 1-6 ) 和 Bax-Bak DKOs (XK 1-8 ) 中Bax、Bak和 ERK蛋白表達的蛋白質(zhì)印跡分析。紅色方形框表示使用批次培養(yǎng)進一步表征的克隆。此外，圖S3描述了Bax、Bax SKO和DKO細胞系所有克隆的批次培養(yǎng)特性。E)和F) Bax SKO、Bak SKO和Bax-Bak DKO細胞系的活細胞密度和細胞活力概況。(黑色)對照CHOK1宿主，(藍色)Bax SKO (CHOX 5 )，(綠色)Bak SKO (CHOK 4 )和(白色)Bax-Bak DKO (CHOXK 6 )。實驗值代表三次生物學(xué)重復(fù)(n = 3)的平均值±SEM。

       結(jié)果

       哺乳動物細胞死亡階段的調(diào)控

       調(diào)控哺乳動物細胞的生長階段，就像在玩一場超復(fù)雜的 "基因拼圖游戲"，每個階段都得精準 "拿捏"（圖 1A）。為了完成這場 "游戲"，我們制定了一套連續(xù)細胞工程方案，分三步 "通關(guān)"：減弱細胞死亡、加速對數(shù)生長期、激活穩(wěn)定期（圖 1B）。

       第一關(guān)，先解決細胞死亡的 "大麻煩"。我們派出 CRISPR/Cas9 這員 "大將"，針對促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 發(fā)起 "進攻"，目標是打造抗死亡的哺乳動物細胞系。就像設(shè)計 "尋寶路線" 一樣，我們根據(jù) Bax 和 Bak 的編碼序列，設(shè)計了三個引導(dǎo) RNA（gRNA），專門 "瞄準" 轉(zhuǎn)錄本外顯子缺失。

       第一輪 "戰(zhàn)斗"，我們分別對 Bax 和 Bak 進行單敲除（SKO），然后用有限稀釋克隆法，像 "大海撈針" 一樣篩選出單細胞克隆。最后成功分離出 5 個 Bax SKO 單細胞克?。–HOX 1 至 CHOX 5）和 6 個 Bak SKO 單細胞克隆（CHOK 1 -CHOK 6）。

       為了確認 "戰(zhàn)斗成果"，我們用 TIDE PCR 在基因組水平上查看是否有插入或缺失，再用 Western blot 在蛋白質(zhì)水平上 "驗明正身"。確認無誤后，我們選了 Bak SKO 克隆 CHOK 1 和 CHOK 6，發(fā)起第二輪 "進攻"，生成 Bax/Bak 雙 KO (DKO) 細胞克隆。又經(jīng)過一番 "精挑細選"，從親本宿主中分離出 8 個 Bax/Bak DKO 細胞克?。–HOXK 1-4 和 CHOXK 5-8），并且所有克隆都在基因組和蛋白質(zhì)組水平上成功實現(xiàn) Bax 和 Bak 敲除。

       對這些克隆進行初步 "體檢"，發(fā)現(xiàn)它們在減緩細胞活力下降方面效果顯著（圖S3）。我們從中挑出 CHOX 5、CHOK 4 和 CHOXK 6 細胞系，和親本 CHOK1 一起進行標準批次培養(yǎng)，看看它們的生長和細胞活力有啥不同。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SKO 和 DKO 細胞系的生長曲線 "神同步"，生長率和細胞密度峰值都差不多，而且細胞活力比對照 "蹭蹭" 往上漲（圖 1D 和 E）。特別是 Bax 和 Bak DKO，在提高細胞活力上還有 "1+1>2" 的協(xié)同效果！這波操作，直接讓細胞死亡大幅減輕！

       細胞抗死亡能力有了，接下來得看看它們的 "生產(chǎn)能力"。我們給 Bax 和 BakDKO 細胞系以及對照 CHOK1 細胞系 "加載" r-IgG1 抗體生產(chǎn)程序，用含有人源 IgG1 抗體序列的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，再經(jīng)過嘌呤霉素抗性篩選，找到單細胞克?。–HOXKIgG1 和 CHOK1 IgG1）。

       在 14 天的標準批次培養(yǎng)中，我們?nèi)?"緊盯" 這些細胞的生長、活力、IgG1產(chǎn)生和凋亡狀態(tài)（圖 2）。結(jié)果令人驚喜！和對照 CHOK1 IgG1 細胞系相比，Bax 和 Bak DKO 細胞系就像開了 "生產(chǎn)外掛"，培養(yǎng)壽命延長，活力滿滿（圖 2A 和 B），IgG1 產(chǎn)量和細胞特異性產(chǎn)量也更高（圖 2C 和 D），而且并不是因為 IgG1 產(chǎn)生細胞系生長過程有變化，而是培養(yǎng)壽命延長帶來的 "福利"。

       我們還仔細檢查了凋亡信號通路，發(fā)現(xiàn) Bax 和 Bak 蛋白 "消失得無影無蹤"，它們的下游效應(yīng)分子（裂解的 caspase 3 和 7 以及 caspase 9）在不同培養(yǎng)時間點的表達也大幅降低（圖 2F）。這直接導(dǎo)致 CHOXK IgG1 在培養(yǎng)第7 天和第 8 天的細胞凋亡數(shù)量顯著減少（圖 2G）。看來，Bax 和 Bak DKO 是通過 "切斷" 下游信號蛋白級聯(lián)反應(yīng)，成功減少了細胞凋亡！

       圖 2.IgG1產(chǎn)生型抗死亡細胞系的開發(fā)。A )、B) 和 C) CHOXK IgG1 和對照 CHOK1 IgG1細胞系的活細胞密度、細胞活力和 IgG1 產(chǎn)生情況。D) 細胞特異性生產(chǎn)力。E) IgG1 重鏈 (HC) 和輕鏈(LC) mRNA 表達。F) 凋亡相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析：Bak、Bax、Caspase 3、7 和 9。G) 使用Annexin V/PI染色進行凋亡分析。(*)、(**)、(***) 和 (****) 分別表示 p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（t檢驗）。實驗值代表三個生物學(xué)重復(fù) (n = 3) 的平均值 ± SEM。

       加速細胞生長：一場需要 "剎車" 的競速賽

       在哺乳動物細胞的 "成長賽道" 上，提升細胞生長速度這事兒，和細胞系開發(fā)、生物工藝放大可算是 "拜了把子"，關(guān)系鐵得很！但要是放任細胞撒丫子瘋長，就好比給沒駕照的新手一輛超跑 -- 麻煩大了！不受控制的快速生長，會讓細胞出現(xiàn)基因型、表型 "大變臉"，還可能觸發(fā)凋亡事件，在培養(yǎng)過程中直接"擺爛"，交出糟糕的 "成績單"。所以說，設(shè)計一套細胞生長加速系統(tǒng)，必須得給它配上 "高精度方向盤" 和 "強力剎車"，實現(xiàn)超穩(wěn)操控！

       為了拿捏住細胞生長的 "命脈"，我們整出了一個超牛的基因組整合系統(tǒng)，它的核心 "操盤手" 是 cMYC 基因 -- 這位可是細胞增殖界的 "明星誘導(dǎo)劑"，名氣響當當！接著，我們又構(gòu)建了一個能被培養(yǎng)基里的脫落酸（ABA）"喚醒" 的誘導(dǎo)性遺傳回路，咱給它取名叫 ABA-MYC。ABA-MYC 系統(tǒng)的 "工作原理" 就像一場精妙的分子 "雙人舞"：當 ABA 出現(xiàn)，PYL1 和 ABI 結(jié)構(gòu)域就開始 "貼貼"，跳起可逆二聚化的 "華爾茲"。這一 "貼" 可不得了，PYL1融合的 VP16 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，就會像被施了魔法一樣，順著 ABA 的 "指揮棒"，精準 "募集" 到和 PhIF 阻遏物（TET 阻遏物的 "親兄弟"）相連的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域上，而這個結(jié)構(gòu)域又和 ABI "手拉手"（見圖 3A）。為了防止ABA-MYC 系統(tǒng)突然 "抽風" 意外啟動，我們還在 PhIF DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和ABI 之間安了個 "核輸出信號（NES）"，就像給它們之間加了一道 "安全門"；同時，給 VP16-PYL1 連上核定位信號，確保分子 "舞蹈" 按劇本走。這些分子元件 "通力合作"，讓二聚化的 PhIF-NES-ABI 和 NLS-VP16-PYL1 順利 "沖進" 細胞核，瞬間激活 cMYC 基因和報告基因 mCherry 蛋白的 "表演"。為啥選 ABA 誘導(dǎo)系統(tǒng)？因為它夠 "低調(diào)"，背景激活值低，一旦被激活，又能 "高調(diào)" 輸出，實現(xiàn)高水平表達，妥妥的 "寶藏選手"！

       為了驗證這套系統(tǒng)是不是真的 "能打"，我們培養(yǎng)出了整合 ABA-MYC 回路的 CHOXKIgG1 細胞系的穩(wěn)定克隆細胞系，這樣就能通過在培養(yǎng)基里加 ABA，像調(diào)節(jié)音量旋鈕一樣，精準控制 cMYC 的 "表達音量"。實驗結(jié)果超給力！通過 ABA-MYC 回路的誘導(dǎo)，我們在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平，都實現(xiàn)了對 cMYC 和 mCherry 基因表達的精準 "拿捏"，而且表達量和 ABA 濃度完美 "掛鉤"（見圖 3B、C 和 D）。cMYC 一被激活，細胞就像打了 "生長雞血"，生長速度狂飆，IgG1 的產(chǎn)量也跟著 "搞事情"。我們發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基里的 ABA 濃度越高，細胞密度就 "蹭蹭" 往上漲（見圖 3E 和 F），細胞活力也跟著 "水漲船高"，這大概是因為 cMYC 對細胞有 "續(xù)命" 的神奇功效。不過，細胞增殖加快，細胞周期分布也 "變了天"：G1 期細胞數(shù)量 "縮水"，G2 期細胞數(shù)量 "暴漲"，只有 S 期 "穩(wěn)如泰山"（見圖 3G）。但在 IgG1 產(chǎn)量這邊，劇情卻來了個大反轉(zhuǎn) --cMYC 表達越高，產(chǎn)物滴度和細胞特異性產(chǎn)量反而越低（見圖 3H 和 I）。這就好比細胞在 "生長" 和 "生產(chǎn)" 之間玩起了 "蹺蹺板"，一方增強，另一方就得 "讓步"。我們檢查了 IgG1 HC 和 LC mRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)沒啥明顯變化，看來 IgG1 產(chǎn)量下降，就是 cMYC 表達 "搞的鬼"！這些數(shù)據(jù)實打?qū)嵉刈C明，cMYC 作為細胞生長加速的 "靶點"，那是相當靠譜！和可誘導(dǎo)系統(tǒng) "聯(lián)手" 后，就能輕松調(diào)控哺乳動物細胞的生長能力。我們還在 CHOK1IgG1 和 HEK293 細胞系里測試了 ABA-MYC 回路，結(jié)果都和之前的實驗 "對上了暗號"，活細胞密度增加，IgG1 產(chǎn)量減少，妥妥的 "實力認證"！

       圖3.開發(fā)一種可編碼cMYC基因表達的脫落酸(ABA)誘導(dǎo)型基因回路，用于調(diào)控IgG1產(chǎn)生型抗死亡細胞系(CHOXK IgG1 -ABA-MYC)的對數(shù)生長期。A ) 表達cMYC和mCherry基因的ABA-MYC回路示意圖，該回路在PhlF可激活啟動子的作用下進行，由最小CMV啟動子上游的六個PhlF操縱子組成。ABA誘導(dǎo)空間分離的PYL1和ABI結(jié)構(gòu)域二聚化，導(dǎo)致PhlF DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而誘導(dǎo)基因表達。B) mCherry熒光表達。C)和D) cMYC分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達。E) 活細胞密度。F) 細胞活力曲線。G) 細胞周期分布。H) IgG1產(chǎn)量滴度。I) 細胞特異性生產(chǎn)力。 J) 和 K) 分別為 IgG1 HC 和 LC mRNA 的表達。(黑色) 未誘導(dǎo)對照，(粉色) 2.5 μM ABA，(紅色) 5 μM ABA 和 (深紅色) 10 μM ABA。(*)、(**)、(***) 和 (****) 分別表示p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（單因素方差分析）。實驗值代表三個生物學(xué)重復(fù) (n = 3) 的平均值 ± SEM。

       誘導(dǎo)穩(wěn)定期：給細胞按下 "暫停鍵" 的魔法

       哺乳動物細胞的穩(wěn)定期，就像細胞生長路上的 "服務(wù)區(qū)"，到了這兒，細胞生長直接 "踩剎車"。這一階段的開啟，可能是被各種內(nèi)在、外在的 "刺激信號" 召喚來的。穩(wěn)定期一到，細胞密度就 "躺平" 保持恒定，細胞周期蛋白也開始 "調(diào)整工作模式"。對哺乳動物細胞生物工藝來說，穩(wěn)定期可是個 "香餑餑"，能大幅提升生產(chǎn)力。但尷尬的是，它常常是因為碰上營養(yǎng) "斷糧"、壓力 "爆表" 等糟糕環(huán)境才出現(xiàn)。所以，我們決定開發(fā)一套 "魔法系統(tǒng)"，能按需誘導(dǎo)穩(wěn)定期，還不折騰培養(yǎng)環(huán)境！

       為了精準控制細胞生長 "踩剎車"，我們圍繞 BLIMP1 基因設(shè)計了一套基因回路。BLIMP1 基因那可是細胞周期和細胞分化領(lǐng)域的 "大佬"，妥妥的 "主調(diào)節(jié)器"！我們借助 Tet-On rtTA/tTS 系統(tǒng)，搭建起 TET-BLIMP1 回路。這個回路就像一個 "雙重保險" 調(diào)控框架：沒有四環(huán)素（TET）時，tTS 蛋白就像個 "嚴厲的監(jiān)工"，死死抑制目的基因（GOI）的表達；一旦 TET 出現(xiàn)，rtTA蛋白立刻 "變身"，成為激活基因表達的 "超級助推器"。tTS 蛋白是 TetR（Tet 阻遏蛋白）和 KRAB-AB（Kid1 蛋白的轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域）"合體" 而成，專門和 TRE 啟動子 "綁定"，掐斷基因轉(zhuǎn)錄的 "電源"；rtTA 蛋白則是rTetR（TetR 突變體）和 VP16 的 "融合戰(zhàn)士"，在 TET 的 "召喚" 下，激活 TRE 啟動子，讓 BLIMP1 基因和報告蛋白 GFP "閃亮登場"（見圖 4A）。這套雙重調(diào)控系統(tǒng)超 "靠譜"，幾乎不會出現(xiàn) "表達泄漏"，對 TET 的響應(yīng)也超靈敏！

       圖4.構(gòu)建四環(huán)素 (TET) 誘導(dǎo)的編碼 BLIMP1 基因表達的基因回路，用于調(diào)控產(chǎn)生 IgG1 的抗死亡細胞系 (CHOXK IgG1 -TET-BLIMP1) 的穩(wěn)定期。A ) TET-BLIMP1 回路示意圖，該回路在四環(huán)素 TREt 啟動子下表達 cMYc 和 GFP 基因。TET 與 rtTA 結(jié)合后，誘導(dǎo) TREt 啟動子基因表達，該啟動子由最小 CMV 啟動子上游的六個 TetO 序列組成。B) GFP 熒光表達。C) 和 D) BLIMP1 分別在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的表達。E) 活細胞密度。F) 細胞活力曲線。G) 細胞周期分布。H) IgG1 產(chǎn)量滴度。I) 細胞特異性生產(chǎn)力。J) 和 K) 分別表示 IgG1 HC 和LC 的 mRNA 表達。（黑色）未誘導(dǎo)對照，（淺綠色）250 ng/mL TET，（綠色）500 ng/mL TET 和（深綠色）1000 ng/mL TET。（*）、（**）、（***）和（****）分別表示 p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（單因素方差分析）。實驗值代表三個生物學(xué)重復(fù)（n = 3）的平均值±SEM。

       我們把 TET 誘導(dǎo)回路整合進 CHOXKIgG1 細胞系，培育出穩(wěn)定細胞系，這樣就能用培養(yǎng)基里的 TET，像調(diào)節(jié)燈光亮度一樣，精準調(diào)控 BLIMP1 的表達。實驗時，往培養(yǎng)基里加 TET，TET-BLIMP1 回路立馬 "開工"，對 BLIMP1 和 GFP基因的調(diào)控效果，在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平都清晰可見（見圖 4B、C 和 D）。BLIMP1 一被激活，細胞生長和 IgG1 產(chǎn)量就開始 "大變樣"，而且變化程度和 TET 濃度 "鎖死"，完美對應(yīng)。隨著 TET 濃度升高，細胞密度就像泄了氣的氣球，逐漸下降（見圖 4E）。和 ABA-MYC 回路激活類似，TET-BLIMP1 回路激活后，細胞活力也 "支棱" 起來了，這大概是因為細胞數(shù)量少了，對 "糧草" 的需求也跟著降低。BLIMP1 讓細胞生長 "踩剎車"，細胞周期也跟著 "停車"：G1 期細胞數(shù)量 "暴增"，G2 期細胞數(shù)量 "暴跌"，S 期依舊 "淡定"（見圖 4G）。在 CHOXK IgG1 細胞里，誘導(dǎo) BLIMP1 簡直像給細胞裝上了 "生產(chǎn)力加速器"，IgG1 滴度飆升 2.1 倍，細胞特異性生產(chǎn)力更是猛增 10 倍（見圖 4H 和 I）！和 ABA-MYC 回路激活的效果一對比，簡直是 "冰火兩重天"，這也實錘了哺乳動物細胞的生產(chǎn)能力和增殖能力之間的 "愛恨情仇"。我們分析了 HC 和 LC 的 r-IgG1 轉(zhuǎn)錄本的 mRNA 表達，發(fā)現(xiàn)沒啥變化，看來 IgG1 產(chǎn)量增加，就是 BLIMP1 "搞的好事"！這些數(shù)據(jù)充分說明，BLIMP1 就是誘導(dǎo)生長停滯、提升細胞生產(chǎn)力的 "潛力股"！和可靠的誘導(dǎo)系統(tǒng)"組隊" 后，就能讓細胞生長穩(wěn)穩(wěn) "減速"，順利進入早期穩(wěn)定期，把哺乳動物細胞的生產(chǎn)力拉到 "滿格"！我們又在 CHOK1IgG1 細胞和 HEK293 細胞里測試了 TET-BLIMP1 回路，結(jié)果依舊 "穩(wěn)如老狗"，活細胞密度下降，IgG1產(chǎn)量增加，完美 "復(fù)刻" 之前的實驗結(jié)果！

       雙重可控系統(tǒng)：細胞生長的 "智能遙控器"

       前面我們成功開發(fā)出了調(diào)控哺乳動物細胞生長階段的 "秘密武器"，能減緩細胞死亡、加速生長期、誘導(dǎo)穩(wěn)定期，ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 回路也用實力證明，它們能各自 "獨當一面"，精準控制細胞的生長期和穩(wěn)定期。但生物工藝這事兒，可比想象中復(fù)雜多了，光有 "單打獨斗" 可不行，還得能實現(xiàn)動態(tài)調(diào)控，才能讓細胞發(fā)揮出最佳 "戰(zhàn)斗力"！想要把這些工具的潛力全挖出來，用在哺乳動物細胞生物工藝上，就得像操控智能家電一樣，能精細調(diào)節(jié)、協(xié)調(diào)細胞的生長期和穩(wěn)定期！

       說干就干！我們開發(fā)出了一個 "雙重可控平臺"，把 ABA-MYC 和 TET-BLIMP1回路都 "打包" 整合到抗死亡 CHOXKIgG1 細胞系里（見圖 5A）。整合完 ABA-MYC 回路的細胞，再 "喂" 上 TET-BLIMP1 回路，接著走細胞系開發(fā)流程，又是抗生素篩選，又是基于 FACS 的限制稀釋克隆，最后進行單克隆選擇，一頓操作猛如虎！為了檢驗 ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 系統(tǒng)的 "雙人配合" 能力，我們通過分析熒光 mCherry 和 GFP 報告基因的表達，測試它們對誘導(dǎo)物的 "敏感度"。結(jié)果超驚喜！整合了兩種基因回路的細胞，對相應(yīng)誘導(dǎo)物那叫一個 "專一"，往培養(yǎng)基里分別加 ABA 和 TET，mCherry 和 GFP 立馬 "亮燈" 表達（見圖 5B 和 C），妥妥的 "指哪打哪"！

       圖 5.哺乳動物細胞生長期和穩(wěn)定期的雙重可控系統(tǒng)。A ) 控制 cMYC（決定生長期）和 BLIMP1（決定穩(wěn)定期）表達的正交遺傳回路示意圖。B) 和 C) 分別在存在和不存在ABA 和 TET 誘導(dǎo)物的情況下的 mCherry 和 GFP 熒光。D) 活細胞密度曲線。E)細胞特異性生長率。F) 細胞活力曲線。G) IgG1 產(chǎn)生。H) 細胞特異性生產(chǎn)力。（黑色）對照條件：CHOXK IgG1 -ABA-MYC/TET-BLIMP1加 2% DMSO，（紫色）誘導(dǎo)條件 CHOXK IgG1 -ABA-MYC/TET-BLIMP1 加ABA 和 TET 分別用于生長期和穩(wěn)定期。生長期（以cMYC激活定義）是通過在第2、4和6天用5 μM ABA誘導(dǎo)ABA-MYC回路實現(xiàn)的。穩(wěn)定期（以BLIMP1激活定義）是通過在第7、10和12天用1 μM TET誘導(dǎo)TET-BLIMP1回路實現(xiàn)的。(*)、(**)、(***)和(****)分別表示p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（二向方差分析）。實驗值代表三次生物學(xué)重復(fù)（n = 3）的平均值±SEM。

       為了測試這套雙重可控系統(tǒng)在實際培養(yǎng)環(huán)境中的 "真本事"，我們制定了一套雙相生物處理策略。第一階段先激活 ABA-MYC 回路，給細胞生長 "踩油門"；等細胞 "跑" 起來了，再激活 TET-BLIMP1 回路，讓細胞 "穩(wěn)穩(wěn)停車"。在生長加速階段，激活 ABA-MYC 回路的細胞，就像裝上了 "渦輪增壓器"，細胞密度 "唰唰" 往上漲，細胞特異性生長率也把未誘導(dǎo)細胞遠遠甩在身后，最高能達到約 18 x 10^6 cells/mL，比未誘導(dǎo)細胞多出 80%（見圖 5）！在 rIgG1產(chǎn)量方面，誘導(dǎo)細胞和未誘導(dǎo)細胞的生產(chǎn)曲線 "神同步"，誘導(dǎo)細胞的產(chǎn)量還略勝一籌，但細胞特異性生產(chǎn)力沒啥差別。不過，和只表達 ABA-MYC 回路的細胞相比，我們這套雙系統(tǒng)在生產(chǎn)力結(jié)果上卻 "鬧起了分歧"。仔細一琢磨，問題可能出在基于 FACS 的克隆選擇過程：當時為了選出 mCherry 和 GFP 表達都 "爆表" 的細胞群體，兩個系統(tǒng)同時激活，結(jié)果一不小心，可能選出了一個被 BLIMP1 "暗中加持"、能力超強的克隆。這也提醒我們，這兩個調(diào)控系統(tǒng)之間的 "互動" 太復(fù)雜，得好好研究，優(yōu)化選擇過程，才能讓調(diào)控更穩(wěn)、更準！

       到了第二階段，我們把加了 ABA 的 "舊培養(yǎng)基" 換成加了 TET 的 "新套餐"，還把誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)細胞的初始濃度都調(diào)成約 8 x 10^6 cells/mL，保證公平 "競技"。這時候激活 TET-BLIMP1 回路，細胞立馬 "急剎車"，生長停滯，細胞特異性生長速率 "斷崖式下跌"，穩(wěn)穩(wěn)進入穩(wěn)定期（見圖 5D 和 E）。BLIMP1 讓細胞密度降低的同時，還順手 "奶" 了一口細胞活力，和只整合 TET-BLIMP1 回路的細胞反應(yīng)一模一樣。在產(chǎn)物生產(chǎn)方面，TET 誘導(dǎo)的細胞直接 "開大"，IgG1 產(chǎn)量和細胞特異性生產(chǎn)力 "原地起飛"，產(chǎn)物滴度暴增 3.2 倍，qP 提升 2.1 倍！

       總的來說，我們成功讓抗死亡細胞系同時 "搭載" ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 通路，而且完全沒有 "表達泄漏"！用獨立的小分子誘導(dǎo)劑，就能像操控遙控器一樣，精準調(diào)控細胞的生長期和穩(wěn)定期。這些成果充分說明，用多層次基因工程方法，在培養(yǎng)過程中調(diào)控哺乳動物細胞生長階段，這事兒絕 對 "有戲"！

       討論

       在細胞研究的江湖里，各路高手都在琢磨怎么拿捏哺乳動物細胞的 "成長密碼"，而我們這次帶來了堪稱 "王炸" 的全面細胞工程策略！這就好比給細胞量身定制了一套超牛的成長指南，精準把控它們的生長節(jié)奏，直接優(yōu)化生物工藝性能，讓細胞們 "打工" 更賣力。

       以前也有不少研究，就像給細胞打了 "興奮劑"，通過組成性過表達控制生長或抑制細胞凋亡的靶點，成功讓細胞在不同生長階段 "聽話"。但咱這次玩的是 "高端局"，別人都是單打獨斗，我們直接對哺乳動物細胞系進行多重工程改造，就像給細胞裝上了三頭六臂，能同時對三個培養(yǎng)階段進行 "顯微鏡級" 的精細控制！

       在這項研究里，我們展示了組合細胞工程方法的 "神仙操作"。一方面，用 CRISPR/Cas9 這把 "基因剪刀"，咔嚓一下敲除促凋亡蛋白，直接掐滅細胞死亡的 "小火苗"；另一方面，在小分子誘導(dǎo)系統(tǒng)的 "指揮" 下，精準控制外源cMYC 和 BLIMP1 基因的表達，讓細胞生長變得像踩油門剎車一樣隨心所欲。這兩招一結(jié)合，就像是給細胞裝上了智能導(dǎo)航，能精準調(diào)控細胞狀態(tài)。想象一下，哺乳動物細胞就像一個個小小的 "生產(chǎn)車間"，我們這套方法就是給車間升級了設(shè)備，能大大提高具有商業(yè)價值的重組產(chǎn)品生產(chǎn)時間和規(guī)模的精準度，讓這些 "車間" 產(chǎn)出翻倍！

       說到這里，得好好嘮嘮我們的 "獨門秘籍"-- 把細胞調(diào)控系統(tǒng)比作汽車發(fā)動機。細胞生長的調(diào)控就像給發(fā)動機裝上了 "油門和剎車踏板"，想加速就踩油門，想減速就踩剎車，精準度、靈活性和可操作性直接拉滿！而減少細胞死亡，就好比給細胞系系上了安全帶，裝上了安全氣囊，讓培養(yǎng)的哺乳動物細胞在 "成長道路" 上穩(wěn)如泰山，再也不怕 "翻車"。

       細胞凋亡可是哺乳動物細胞培養(yǎng)中的 "頭號殺手"，專門搞破壞。不過別慌，當cMYC 和 / 或 BLIMP1 表達被誘導(dǎo)時，減弱細胞凋亡就成了超厲害的 "安全衛(wèi)士"，能把凋亡信號的 "攻擊" 擋在門外。我們的數(shù)據(jù)也超給力，雙 Bak 和 Bax KO 就像兩個勇猛的 "基因戰(zhàn)士"，通過下調(diào)下游凋亡信號通路（Caspase3、7 和 9），有效減輕細胞死亡，直接延長了細胞的 "壽命" 和活力，就像給細胞打了 "續(xù)命針"。而且就算對這些 "抗死亡細胞系" 再進行基因操作，它們依然能 "堅守崗位"，抗死亡表型韌性十足，堪稱細胞界的 "小強"！這和之前的研究結(jié)果也對上了，之前就有研究發(fā)現(xiàn)，同時敲除 Bak 和 Bax 或過表達抗凋亡蛋白，也能讓細胞活力大增，看來我們這次是找對 "路子" 了！

       再來說說我們開發(fā)的 "油門和剎車踏板" 系統(tǒng)，這可是 "師出有名"，借鑒了B 細胞和漿細胞固有的調(diào)節(jié)機制。經(jīng)過實戰(zhàn)檢驗，它調(diào)節(jié)哺乳動物細胞生長率的能力那是杠杠的！cMYC 驅(qū)動的油門踏板就像個 "急性子"，靈活性和響應(yīng)能力滿分，在標準批次設(shè)置范圍內(nèi)，能讓活細胞密度 "嗖" 地一下就沖到和補料分批培養(yǎng)相似的水平，簡直是細胞生長的 "加速器"。這也讓我們看到了設(shè)計基因組整合系統(tǒng)的巨大潛力，以后說不定能減少對昂貴的富集培養(yǎng)基 / 補料的依賴，給生物工藝 "降本增效"！

       而基于 BLIMP1 的剎車踏板也不甘示弱，它就像個 "穩(wěn)壓器"，能提前讓細胞進入穩(wěn)定期，而且不受特定培養(yǎng)基成分消耗的影響，想讓細胞 "剎車" 就 "剎車"。這個穩(wěn)定期誘導(dǎo)系統(tǒng)不僅能根據(jù)細胞特性定制生產(chǎn)力，還能把細胞生產(chǎn)生物制藥的潛力全都 "榨" 出來。要是這兩個系統(tǒng)聯(lián)手，那就是 "王炸組合"，能全方位控制培養(yǎng)中哺乳動物細胞的行為和表型。我們開發(fā)的雙控細胞系，就像給細胞安排了一場 "速度與激情" 的旅程，先踩油門讓細胞快速生長，再踩剎車進入減速階段，在整個培養(yǎng)過程中充滿了變數(shù)和驚喜，還能精準控制哺乳動物細胞的關(guān)鍵性能參數(shù)。雖然我們只展示了一種潛在模式，但在補料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)模型里，還有超多 "隱藏玩法" 等著我們?nèi)ソ怄i！

       把目光放長遠，這套系統(tǒng)的應(yīng)用前景那可是一片光明！我們完全可以定制類似的系統(tǒng)，讓它去 "征服" 各種各樣的生物功能，解決不同的生物工藝挑戰(zhàn)。想象一下，開發(fā)出能在特定培養(yǎng)階段減輕氧化或內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 應(yīng)激的系統(tǒng)，就像給細胞請了 "私人保鏢"，專門應(yīng)對各種 "危險"，這簡直就是多因素生物工藝障礙的 "萬能鑰匙"！我們還打算為 r 生物藥物建立精確的可誘導(dǎo)基因表達系統(tǒng)，讓它能 "察言觀色"，根據(jù)特定的培養(yǎng)階段做出反應(yīng)。這樣就能在細胞生產(chǎn)力最大化的培養(yǎng)階段，專門激活 r 基因的表達，給細胞系開發(fā)過程 "減負"，再也不用讓基因一直 "加班" 了。不管是單獨使用這些 "黑科技"，還是讓它們組團 "出戰(zhàn)"，都是為了讓細胞在復(fù)雜的生物工藝環(huán)境中，變得更 "抗造"、更能 "打"！

       不過話說回來，我們提出的這種創(chuàng)新方法，雖然給擴大哺乳動物細胞平臺規(guī)模帶來了新希望，那些 ABA 或 TET 等小分子誘導(dǎo)的遺傳回路也很強大、靈活，但它們想 "進軍" 工業(yè)界，還得好好 "考核" 一番。誘導(dǎo)系統(tǒng)確實是調(diào)整細胞性能的 "得力助手"，能從細胞內(nèi)部實現(xiàn)工藝強化，甚至賦予細胞新功能，讓工藝過程更靠譜。但它也有 "小毛病"，對小分子誘導(dǎo)劑的依賴可能會增加生物藥物的生產(chǎn)成本，而且在下游工藝中去除這些分子也是個 "老大難" 問題。

       別擔心，我們早就想好 "對策" 了！我們建議應(yīng)用基于內(nèi)源性調(diào)節(jié)機制的 "油門和剎車踏板" 控制。未來可以探索使用特定啟動子，這些啟動子就像細胞里的"智能開關(guān)"，能在特定生長階段或響應(yīng)特定環(huán)境信號（比如細胞內(nèi)代謝物或溫度）時自動激活，替代小分子誘導(dǎo)劑。最近的研究也給我們 "打了氣"，利用低溫條件引導(dǎo)細胞系向特定表型進化，說不定能成為新的突破口。這些策略要是成功了，就能設(shè)計出超智能的遺傳回路，讓細胞自己根據(jù)培養(yǎng)環(huán)境變化做出反應(yīng)，徹底擺脫對小分子的依賴，為細胞系開發(fā)和工藝優(yōu)化打開新世界的大門！

       當然，想要這套系統(tǒng)在生物生產(chǎn)領(lǐng)域 "大展拳腳"，還有不少 "關(guān)卡" 要闖。為了展示 "油門和剎車踏板" 方法的原理，我們在簡單的批次培養(yǎng)條件下做了研究，這樣能更清楚地評估工程基因回路對細胞生長和生產(chǎn)力的影響，不受補料分批條件下培養(yǎng)環(huán)境變化的干擾。但我們也知道，生物制藥生產(chǎn)的 "行業(yè)頂流"是強化補料、優(yōu)化補料方案，還有連續(xù)灌流培養(yǎng)系統(tǒng)。所以研究這套方案在補料分批和灌流系統(tǒng)中的適用性，就是我們接下來的 "重頭戲"。特別是灌流系統(tǒng)，工程細胞平臺的長期穩(wěn)定性是關(guān)鍵，工業(yè)應(yīng)用需要對生產(chǎn)和表型穩(wěn)定性進行 "魔鬼測試"，通常得讓細胞傳代培養(yǎng)超過 100 天，還要仔細評估培養(yǎng)性能參數(shù)。只有通過了這項測試，才能保證在工業(yè)細胞系開發(fā)過程中，產(chǎn)量穩(wěn)定又可靠！

       為了讓這套系統(tǒng)更 "完美"，我們還瞄準了兩個關(guān)鍵領(lǐng)域。第一個領(lǐng)域是優(yōu)化細胞生長和生產(chǎn)之間的平衡，就像在走鋼絲，要找到那個 "完美支點"，提高整體產(chǎn)品產(chǎn)量。我們打算用實驗設(shè)計 (DoE) 方法，就像給細胞做 "排列組合游戲"，系統(tǒng)地探索不同的誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間，精準微調(diào)細胞生長和生產(chǎn)率之間的平衡，實現(xiàn)高細胞密度和高生產(chǎn)率的 "雙贏"！第二個領(lǐng)域是提高重組蛋白的產(chǎn)量，我們要在細胞生產(chǎn)率最大化的培養(yǎng)階段，專門定制轉(zhuǎn)基因表達，給細胞 "開小灶"，減輕組成型表達的代謝負擔，讓復(fù)雜分子的產(chǎn)量 "蹭蹭" 往上漲。這些研究要是順利，就能助力我們的新型細胞平臺從 "實驗室明星" 成功轉(zhuǎn)型為 "工業(yè)生產(chǎn)主力"！

       雖然這套系統(tǒng)在 r - 單克隆抗體上已經(jīng) "大顯身手"，但它和其他 IgG 型分子（比如 Fc 融合蛋白或多特異性抗體）能不能 "友好相處"，還是個未知數(shù)。而且它能不能攻克低滴度高度復(fù)雜蛋白質(zhì)生產(chǎn)的難關(guān)，也值得我們在未來好好探索一番。不過總的來說，這項研究讓我們看到了合成生物學(xué)工具和組合工程方法的無限潛力，說不定未來真能開發(fā)出高度可控的哺乳動物細胞工廠，讓細胞們成為生物生產(chǎn)領(lǐng)域的 "超級工人"！

       原文：M. Torres, D. Mcconnaughie, S. Akhtar, et al., Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metabolic Engineering, 2024.