雙旁位抗體（bpAbs）結(jié)合抗原上不同的、不重疊的表位。這種獨特的結(jié)合模式實現(xiàn)了超越單特異性和雙特異性抗體（bsAbs）的新作用機制，使bpAbs成為各種適應癥（包括腫瘤學和傳染病）的有效療法。雙旁位結(jié)合可導致卓越的親和力和特異性，促進拮抗作用，鎖定靶標構(gòu)象，并導致更高階的靶標聚集。這種抗體-靶標復合物可以引起強烈的激動，增加免疫效應器功能，或?qū)е驴焖傧抡{(diào)靶標和溶酶體運輸。這些不僅是治療性抗體的有吸引力的特性，而且越來越多地被探索用于其他形式，例如抗體-藥物偶聯(lián)物、T細胞接合器和嵌合抗原受體。bpAb工程的最新進展使構(gòu)建更復雜的構(gòu)型成為可能，這些構(gòu)型開始在臨床上顯示出前景。

       【NO.1】介紹

       2022年，抗體療法占美國新藥批準的30%。在正在開發(fā)的抗體中，已經(jīng)觀察到包括雙特異性抗體（bsAbs）在內(nèi)的高度工程化分子的數(shù)量顯著增加。雙旁生抗體（bpAbs）是bsAb的一個子集，對同一分子靶標上的獨特、不重疊的表位具有特異性。這種獨特的結(jié)合模式成立于30多年前，可實現(xiàn)差異化的作用機制（MoA）。在過去的十年中，隨著臨床試驗的首次成功，bpAbs的治療潛力變得明顯。這些開創(chuàng)性的分子為當今臨床開發(fā)中越來越多的bpAb鋪平了道路（表1)。本文概述了bpAb的多種形式和MoA、當前的臨床流程和前景。

       表1.臨床中的雙旁位抗體。分子按第一次臨床試驗開始的時間順序列出

       【NO.2】雙抗體決定簇構(gòu)型

       抗體發(fā)現(xiàn)和工程技術(shù)的進步使越來越復雜的bpAb形式成為可能，這些形式可以針對不同結(jié)構(gòu)中的不同表位組裝結(jié)合結(jié)構(gòu)域。形式的選擇取決于靶生物學和建議的MoA。關(guān)鍵的設(shè)計考慮因素包括靶向表位、單個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和性質(zhì)、增加的半衰期延長和效應子功能介導結(jié)構(gòu)域，以及確保將所有結(jié)構(gòu)域正確組裝成功能性bpAb的策略。后者可以像在單個蛋白質(zhì)中用靈活的接頭連接單個結(jié)構(gòu)域一樣簡單，或者在含有bpAb的可結(jié)晶片段（Fc）結(jié)構(gòu)域中，取決于最多四種不同蛋白質(zhì)的正確配對，分別在重鏈（HC）和輕鏈（LC）中具有相應的轉(zhuǎn)向突變。生產(chǎn)性表位對很難合理預測或使用抗體混合物預測。因此，以給定bpAb構(gòu)型高效生成和篩選表位對的大基質(zhì)的能力是關(guān)鍵。除了功能和可行性之外，在選擇bpAb形式時，可開發(fā)性考慮因素也至關(guān)重要。及早檢測BPAb的生物物理責任可以降低動物研究和臨床試驗失敗的風險。同樣，由于bpAb構(gòu)型復雜性可能導致可開發(fā)性差或副產(chǎn)品錯配，因此bpAb形式的選擇會影響下游生產(chǎn)和質(zhì)量控制。

       迄今為止在臨床上測試的bpAb不僅具有多種形式，而且還利用了大量不同的單個結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖1)。單鏈抗體形式，尤其是單結(jié)構(gòu)域抗體（sdAbs）和單鏈可變片段（scFvs），很容易以雙旁生形式配對。因此，首批進入臨床的兩個bpAbALX-0651和BI1034020，由串聯(lián)sdAb組成?；诳贵w片段的bpAb在循環(huán)中通常半衰期較短，需要進一步工程改造以改善暴露。小尺寸使sdAb成為嵌合抗原受體（CAR）的理想組成部分，正如雙旁位CAR-T療法cilta-cel所強調(diào)的那樣和OriCAR-017。

       圖1.在臨床試驗中評估的bpAb架構(gòu)。REGN5093-M114每個抗體平均包含3.2種非特異性偶聯(lián)藥物。MBS301不含六聚化增強突變；*藥物抗體比和偶聯(lián)位點與所示示例不同。

       迄今為止，在臨床上測試的大多數(shù)bpAb都具有更典型的含F(xiàn)c的結(jié)構(gòu)，可以通過HC軸的對稱性（圖1)。對稱bpAb由相同的HC或HC/LC對組成，而不對稱分子由具有不同結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同半部分組成。四價分子MEDI4276和BAT2022是具有2+2化合價（每個整數(shù)描述分子中存在的相同旁位的數(shù)量）和scFvs或sdAb的示例，分別附加到HC的N端或C端。另一方面，KN060是一種對稱的bpAb，具有串聯(lián)的sdAb臂，沒有LC。與KN060類似，三特異性TAVO412通過嵌入更復雜的不對稱構(gòu)型的串聯(lián)sdAb臂實現(xiàn)雙旁位靶向。不對稱bpAb通常依賴于Fc突變來促進bpAb產(chǎn)物的純化或指導異二聚體的形成。例如，REGN5093的兩種HC經(jīng)過工程改造，對蛋白A表現(xiàn)出不同的親和力，并允許純化異二聚體產(chǎn)物。另一方面，GEN3009是一種不對稱的bpAb，具有Fc結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)向突變，可確保兩種不同HC的正確配對。除了HC異二聚化之外，正確的LC配對對于不對稱bpAb來說可能是一個挑戰(zhàn)。在GEN3009示例中，通過兩個母體抗體的溫和體外反應實現(xiàn)正確配對，該反應允許HC重組，而不會擾亂原始LC配對。REGN5093說明了一種完全避免LC配對問題的替代策略，它由兩個不同的HC與兩個相同的LC配對組成。這種常見的液相色譜可以直接從具有明確液相色譜多樣性的發(fā)現(xiàn)平臺（如REGN5093例）獲得，也可以從現(xiàn)有液相色譜（如anbenitamab和GR2002）衍生而來。ISB1442和SAR441236是不對稱bpAb的例子，它們分別通過額外的Fab或scFv結(jié)構(gòu)域擴展免疫球蛋白G（IgG）結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)更高的化合價，甚至在SAR441236的情況下實現(xiàn)三旁位結(jié)合。較小的非對稱構(gòu)型，例如基于fragment-Fab的zanidatamab或基于片段的TNB-738也可以被利用。Zanidatamab將scFv結(jié)構(gòu)域與完整的Fab臂配對，而TNB-738的結(jié)合臂來自兩個sAb，并添加了惰性LC以實現(xiàn)可制造性。除了免疫球蛋白折疊之外，一種雙旁位設(shè)計的錨蛋白重復蛋白（DARPin）MP0274突出了替代支架的潛力。Labrijnetal..全面介紹了所有雙特異性形式。

       【NO.3】bpAbs的MoAs

       3.1雙旁位靶向可通過親和力增強結(jié)合

       與其他抗體相比，與同一靶標上的兩個不同、不重疊的表位結(jié)合導致bpAb具有獨特的特性。與單旁原母抗體相比，許多bpAb表現(xiàn)出更好的結(jié)合和更慢的與靶標的解離。這是在相同（順式）或不同（反式）靶分子（圖2a)。親和力定義為單個分子的多個非共價相互作用的組合，以及一旦建立第一次相互作用，結(jié)合和再結(jié)合事件的可能性就會增加。靶向不同表位的抗體片段可以通過親和力進行連接，以增加靶標親和力，正如基于sdAb的、經(jīng)過臨床評估的bpAbsALX-0651和BI1034020所強調(diào)的那樣。與單價或二價單克隆抗體（mAb）相比，bpAb的解離速度可能非常慢，使其成為更優(yōu)的拮抗劑或反向激動劑。順式結(jié)合形成1：1 bpAb靶標復合物對于此類應用以避免不需要的激動劑活性非常重要。除了表位選擇之外，結(jié)合結(jié)構(gòu)域的幾何排列、sdAb接頭優(yōu)化和親和力調(diào)整對于實現(xiàn)所需的MoA和最大化療效也至關(guān)重要。Kast及其同事證明，結(jié)合域的幾何形狀對于雙旁位和四價融合蛋白的人表皮生長因子受體2（HER2）拮抗作用至關(guān)重要，某些構(gòu)型顯示出激動劑活性。同樣，三位抗表皮生長因子受體（EGFR）IgG-纖連蛋白融合的不同結(jié)構(gòu)在受體下調(diào)方面顯示出不同的療效。對于基于sCDab的拮抗劑，最佳方向和接頭特性可以通過順式中的avid結(jié)合實現(xiàn)超高親和力。最后，臨床bpAb ISB1442依賴于仔細調(diào)整CD38和CD47親和力，以降低靶向毒性。ISB1442的抗CD47Fab經(jīng)過工程改造，具有弱親和力，可與CD47陽性紅細胞實現(xiàn)最低反應性。高親和力、雙旁位、抗CD38臂能夠?qū)D38低腫瘤細胞進行狂熱的靶標參與和高特異性。

       圖2.bpAbs的MoAs。（a）bAb在cis或trans中avid靶標結(jié)合的示意圖。BpAbs可以解鎖新的生物活性，例如（b）雙途徑抑制，（c）將胞外結(jié)構(gòu)域鎖定在酶非活性狀態(tài)，或（d）雙旁位受體靶向形成更高階的復合物并引發(fā)激動。（e）或者，反式bpAb結(jié)合的受體和Fc結(jié)構(gòu)域聚集可導致快速內(nèi)化和溶酶體運輸或強效應功能，特別是補體依賴性細胞毒性。

       bpAbs的高親和力和緩慢解離對于免疫細胞的募集也很有吸引力。例如，Liu及其同事通過將兩個靶向不重疊表位的sdAb與抗CD3Fab融合，設(shè)計了一種參與抗HER2bpAb的T細胞。所得構(gòu)建體顯示，與相應的單旁位母體分子相比，與HER2陽性細胞的結(jié)合增加了30倍，并且在HER2低表達模型中體內(nèi)具有優(yōu)異的腫瘤抑制活性。同樣，Rennert等人設(shè)計了一種針對C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族12成員A（CLEC12A）的雙旁位橋接蛋白，該蛋白由抗CD19CAR-T細胞分泌并募集。雙旁原靶向?qū)崿F(xiàn)的高親和力導致抗CD19CAR-T細胞毒性增加。由于sdAb體積小，CAR可以直接配備bpAbs，正如cilta-cel所強調(diào)的那樣和OriCAR-017。這種CAR的高親和力雙旁位結(jié)合可以導致增強和持續(xù)的療效。如上所述，對于基于sCDab的拮抗劑，仔細選擇表位和接頭優(yōu)化可能是關(guān)鍵。

       3.2 bpAbs可實現(xiàn)雙途徑抑制，并可以鎖定受體和外胚酶的構(gòu)象

       與兩個不重疊的表位結(jié)合可以解鎖bpAb的獨特活性。例如，雙途徑抑制是通過靶向bpAb的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6（LRP6）實現(xiàn)的，以同時阻斷Wnt1和Wnt3a介導的β-catenin信號通路，特別是沒有激動劑活性。圖（2b)，或者，bpAb可以通過物理限制來滅活其靶標。靶向亞結(jié)構(gòu)域I和IV的雙旁位抗HER2 DARPin的晶體結(jié)構(gòu)揭示了兩種HER2受體的結(jié)合和扭曲，從而阻止了與EGFR家族成員形成信號轉(zhuǎn)導能力二聚體。此外，針對CD38和CD73的bpAb，包括臨床bpAbTNB-738，通過將各自的細胞外結(jié)構(gòu)域鎖定在催化失活狀態(tài)（圖2c)。雖然單個母體抗體沒有顯示出任何活性，但抗CD73bpAb具有亞納摩爾活性并達到90%>抑制。

       3.3雙抗原可形成免疫復合物，導致激動、快速靶標內(nèi)化、溶酶體運輸和免疫效應器功能改善

       bpAb的一個獨特特征是它們能夠通過在反式中同時結(jié)合兩個不重疊的表位來形成高階免疫復合物。靶標交聯(lián)是多種MoA的基礎(chǔ)，包括增強的激動作用、Fc介導的效應子功能或可溶性靶標的清除以及受體下調(diào)。

       bpAb的聚集可以促進激動性，特別是對于依賴交聯(lián)進行有效下游信號轉(zhuǎn)導的受體（圖2d)。例如，腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）的成員因其在免疫調(diào)節(jié)和細胞增殖中的作用而成為重要的治療靶標。TNFRSF靶向mAb通常依賴于Fc受體介導的高階聚集，這阻礙了其治療應用。Yang及其同事最近表明，針對TNFRSF成員OX40和死亡受體5（DR5）的四價bpAb實現(xiàn)了優(yōu)于外源交聯(lián)母mAb的強大內(nèi)源激動作用，突出了bpAb激動劑的潛力。BpAb也可能具有激活多組分受體復合物的獨特位置。例如，Shi等人設(shè)計了一種靶向β-klotho的兩個不同表位的bpAb，-klotho是成纖維細胞生長受體1c（FGFR1c）的共受體。雙旁位靶向?qū)τ谝l(fā)有效的激動既必要又充分。

       bpAbs的受體聚集增加了Fc結(jié)構(gòu)域的局部濃度，從而導致效應器功能的改善（圖2e)。已在mAb靶向的多價復合物中觀察到這種效應，例如治療性mAb利妥昔單抗靶向的B細胞標志物CD20?？贵w的雙旁原結(jié)合可以將這種MoA擴展到更多靶標。例如，由于Fc結(jié)構(gòu)域預組織和導致的C1q沉積增加，與母體mAb的組合相比，zanidatamab形成大的HER2簇被證明會導致更有效的補體依賴性細胞毒性（CDC）。通過在Fc結(jié)構(gòu)域中引入六聚化增強點突變，這種作用在抗CD37bpAbGEN3009中進一步放大。雖然不太明顯，但bpAbs的Fc聚集已被證明通過增加與自然殺傷（NK）細胞上FcγRIII受體的結(jié)合，進一步改善抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。類似地，抗白細胞介素6（IL6）bpAb形成簇用于增加Fcγ受體與吞噬細胞的結(jié)合并促進可溶性靶標的快速清除。

       交聯(lián)受體筏已被證明可快速內(nèi)化并轉(zhuǎn)運至溶酶體，導致靶標快速下調(diào)。圖（2e)。值得注意的是，交聯(lián)效率和相關(guān)效應可能取決于表位選擇以及bpAb：靶標幾何形狀?？焖賰?nèi)化和溶酶體運輸使bpAb越來越成為抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）的構(gòu)建單元，它們驅(qū)動腫瘤遞送和細胞毒性有效載荷的細胞內(nèi)釋放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatamab zovodotin（由Zymeworks Inc研發(fā)的一種生物藥，是一種HER2拮抗劑）所示。與單旁位素藥物相比，雙旁生抗葉酸受體α（FRα）ADCIMGN151表現(xiàn)出優(yōu)異的有效載荷遞送。由于這種效應與細胞表面的FRα密度無關(guān)，因此推測IMGN151有效載荷遞送的增加是促進FRα陽性細胞上結(jié)合事件的結(jié)果，而不是聚集，聚集應該隨著受體密度的增加而減少。然而，這兩個MoA并不相互排斥，需要進一步研究來闡明IMGN151的MoA。

       3.4不同表位同時結(jié)合可以克服耐藥機制

       治療病毒感染的一個常見挑戰(zhàn)是找到一種廣泛中和抗體（bnAb），該抗體可結(jié)合外殼蛋白的保守區(qū)域并產(chǎn)生持久的反應。單特異性抗體可以靶向保守區(qū)域，但由于它們對病毒施加選擇性壓力，因此容易受到突變逃逸的影響。原則上與使用小分子藥物的混合物類似，bnAb的組合已被證明可通過減少單藥突變逃逸變異的機會來降低單藥治療耐藥性。雙旁位bnAb結(jié)合了混合物的臨床益處和單藥給藥的易用性，使其成為一個令人興奮的開發(fā)領(lǐng)域。BAT2022，靶向嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的雙旁原bnAb被證明可與所有主要關(guān)注的變體結(jié)合，包括不再被親本抗體之一識別的受體結(jié)合域（RBD）突變體。對于HIV，三旁位bnAb SAR441236和幾種臨床前分子通過靶向病毒外殼蛋白上的多個表位顯示出前景。

       防止耐藥性的多旁位靶向在臨床上也可用于腫瘤相關(guān)抗原（TAA）靶向。腫瘤細胞可以消除靶向表位，例如通過選擇性剪接。據(jù)推測，雙旁位CAR-T細胞可以通過同時靶向兩個表位來防止腫瘤逃逸。雖然進一步的機制研究很重要，但這是癌癥免疫治療的一個有趣前景。盡管概念不同，但Spangler及其同事證明，三旁EGFR靶向可以恢復對下游信號通路突變的西妥昔單抗耐藥異種移植模型的療效。最有效的三旁原位構(gòu)建體實現(xiàn)了單獨使用雙旁位或單旁位構(gòu)建體無法實現(xiàn)的必要受體下調(diào)水平。

       【NO.4】治療應用和方式

       迄今為止，大多數(shù)bpAb已被開發(fā)用于腫瘤學應用，并且cilta-cel是首個基于bpAb的細胞療法已獲批用于復發(fā)和難治性多發(fā)性骨髓瘤。許多其他BPAb目前正處于血液系統(tǒng)癌癥的早期臨床試驗中，包括ISB1442和OriCAR-017，它們都處于I期，用于治療復發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤。

       對于實體瘤的治療，許多bpAb靶向HER2，它是一種受體酪氨酸激酶，參與包括細胞增殖在內(nèi)的各種細胞功能。在20-25%的乳腺癌患者中觀察到高水平的HER2過表達。用分別與非重疊結(jié)構(gòu)域IV和II結(jié)合的臨床mAb曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合靶向兩個不同的HER2表位，先前已被證明可顯著改善治療結(jié)果和預后。HER2的重要性和雙表位靶向的臨床先例可能解釋了正在研發(fā)的大量抗HER2雙抗體，包括anbenitamab和zanidatamab，這是兩種臨床上最先進的HER2靶向bpAbs。bpAb也追求其他重要的腫瘤靶點，包括間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（MET）和FRα分別通過REGN5093（?M114）和IMGN151。

       除腫瘤學外，臨床候選藥物SAR441236和BAT2022突出了BPAb在傳染病中的潛力。抑制bnAb在急性感染中廣泛實施的一個挑戰(zhàn)是逃逸變體的出現(xiàn)，正如最近的SARS-CoV-2大流行所說明的那樣。靶向單個表位的mAb僅在突變逃逸變異發(fā)展并廣泛傳播之前有效，從而使現(xiàn)有療法無效。針對多個表位的BnAb，例如SARS-CoV-2靶向bpAbBAT2022或HIV靶向三旁抗體SAR441236，可以克服急性和慢性疾病中出現(xiàn)的單突變逃逸變異，從而實現(xiàn)持續(xù)使用和更持久的患者反應。

       大多數(shù)臨床bpAb作為裸抗體發(fā)揮作用，以治療病毒感染，通過相應的受體抑制或促進細胞信號傳導，或者如TNB-738的情況，通過抑制酶活性。作為ADC的一部分，bpAb越來越多地用于有效載荷輸送如上所述，由于它們獨特的MoA可促進內(nèi)化和溶酶體運輸。目前有6種雙旁生ADC正在臨床評估中，其中3種也作為裸bpAb進行研究。此外，bpAb的高親和力和選擇性對于高效的T細胞募集劑和CAR的工程設(shè)計具有吸引力。

       在本文中，我們討論了已經(jīng)或正在臨床上針對可獲得數(shù)據(jù)的分子測試的bpAb的結(jié)構(gòu)、MoA和活性。

       ALX-0651

       Ablynx的ALX-0651是一種雙旁位CXCR4靶向串聯(lián)sdAb，是第一個臨床上使用的抗GPCR的生物制劑，據(jù)我們所知，它是第一個進入臨床的bpAb（2011年）。雖然ALX-0651的單個sdAb構(gòu)建單元顯示出中性拮抗劑活性，但雙旁位ALX-0651不僅表現(xiàn)出更高的親和力，而且顯示出對CXCR4的反向激動劑活性。由于缺乏優(yōu)于護理標準，ALX-0651已停產(chǎn)。

       BI1034020

       BI1034020是由Ablynx和BoehringerIngelheim開發(fā)的雙旁生、半衰期延長的串聯(lián)sdAb。該bpAb靶向大腦中β淀粉樣蛋白（Aβ）的兩個獨立表位，旨在用于治療阿爾茨海默病。BI1034020的I期研究始于2013年，但在發(fā)生與藥物相關(guān)的嚴重不良事件后停止。

       MEDI4276

       MEDI4276是由Medimmune開發(fā)的抗HER2ADC，于2015年進入臨床。MEDI4276由基于曲妥珠單抗scFv靶向結(jié)構(gòu)域IV的四價bpAb組成，該結(jié)構(gòu)域在N端與mAb39S靶向結(jié)構(gòu)域II的重鏈融合。該bpAb將四個位點特異性偶聯(lián)的微管溶血素有效載荷遞送給HER2過表達的腫瘤細胞，其中ADC被內(nèi)化并轉(zhuǎn)運到溶酶體以釋放細胞毒性有效載荷。與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合相比，MEDI4276可以通過將HER2運輸從回收重定向到溶酶體降解來交聯(lián)受體，從而實現(xiàn)快速內(nèi)化和高效的細胞質(zhì)遞送。在I期劑量遞增研究中，MEDI4276在HER2陽性乳腺癌和胃癌中顯示出臨床活性，但最終由于不良毒性特征而停止。

       Ciltacabtagene autoleucel

       據(jù)我們所知，Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）是迄今為止第一個也是唯一一個獲批的基于bpAb的療法。cilta-cel最初由傳奇生物開發(fā)，名稱為LCAR-B38M，是第二代自體CAR-T療法，具有雙旁位胞外結(jié)構(gòu)域和兩個靶向B細胞成熟抗原（BCMA）上不同表位的sdAb。Cilta-cel于2022年獲得批準，基于CARTITUDE-1Ib/II期研究（NCT03548207），該研究顯示其反應深刻而持久，安全性可控。97.9%的總體緩解率甚至高于初始I期研究（NCT03090659）中觀察到的87.8%。

       Zanidatamab和zanidatamab zovodotin

       bpAb zanidatamab（ZW25）源自Zymeworks專有的AzymetricFc平臺，將靶向IV的HER2結(jié)構(gòu)域scFv與識別結(jié)構(gòu)域II的Fab臂相結(jié)合。Zanidatamab以反式方式結(jié)合兩個HER2分子，在細胞膜上誘導不同的受體重組。除了快速內(nèi)化和下調(diào)外，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的聚集還會引發(fā)強CDC，這在曲妥珠單抗、帕妥珠單抗或它們的組合中均未觀察到。與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合相比，雙旁位HER2參與在體內(nèi)異種移植模型中導致卓越的抗腫瘤活性。Zanidatamab被證明對患有一系列具有不同HER2表達水平的腫瘤的患者是安全的。Zanidatamab目前正在多項臨床試驗中進行研究，包括乳腺癌（NCT04224272）的II期試驗和晚期胃食管腺癌（NCT05152147）的III期試驗。Zanidatamab也正在探索用于遞送細胞毒性微管蛋白抑制劑。這種雙旁位ADCzanidatamabzovodotin（ZW49）已被證明是免疫原性細胞死亡標志的強誘導劑，并且對具有一系列HER2表達的乳腺癌和胃癌患者來源的異種移植模型具有高度活性。I期臨床試驗目前正在進行中（NCT03821233）。

       MP0274系列

       MP0274由Molecular Partners開發(fā)，通過DARPins實現(xiàn)雙旁位HER2靶向，DARPins是可以像串珠一樣連接的替代支架。四價MP0274分子分別包含一個針對HER2靶結(jié)構(gòu)域I和IV的DARPin，以及兩個用于延長半衰期的人血清白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。與基于IgG的抗HER2bpAb一樣，MP0274與HER2受體交聯(lián)，導致在各種HER2陽性細胞系和小鼠模型中具有與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗聯(lián)合治療相當?shù)目鼓[瘤活性。然而，MP0274可能通過穩(wěn)定AKT調(diào)節(jié)的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOX03a導致誘導細胞凋亡而表現(xiàn)出獨特的MoA。在HER2陽性實體瘤患者的I期研究中，MP0274顯示出良好的暴露和良好的安全性。然而，出于戰(zhàn)略原因，MP0274的進一步臨床開發(fā)已停止。

       Anbenitamab和JSKN003

       康寧杰瑞腫瘤科設(shè)計了一種基于曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的雙旁位HER2靶向抗體anbenitamab（KN026）。相應HC的異二聚體Fc配對是通過將旋鈕插入孔和靜電轉(zhuǎn)向突變相結(jié)合實現(xiàn)的?；贖ER2相互作用殘基的結(jié)構(gòu)解析，設(shè)計了一種可以分別與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗HC高效配對的通用液相色譜。與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗聯(lián)合治療相比，所得的bpAb anbenitamab在具有不同HER2水平和小鼠模型中活性相當?shù)膸追N腫瘤細胞系中顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性。初步表征表明，anbenitamab保留了在母體mAb中觀察到的ADCC和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP），同時與HER2的兩個不同表位結(jié)合。Anbenitamab于2018年進入臨床，并在晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中顯示出良好的安全性，這些患者至少在包括曲妥珠單抗在內(nèi)的一種先前治療中取得了進展。Anbenitamab在第二項臨床試驗中耐受性良好，包括表達HER2的晚期胃癌和胃食管結(jié)合部癌患者?；诹己玫某跏蓟钚裕琣nbenitamab目前正在多項臨床試驗中進行評估，包括兩項注冊研究，作為HER2陽性晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌（NCT05427383）的二線治療和HER2陽性復發(fā)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌（NCT05838066）的一線治療，兩者均與化療聯(lián)合使用。anbenitamab與拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的偶聯(lián)提供了雙旁位抗HER2ADCJSKN003，目前正在晚期實體瘤（NCT05494918）的首次人體I期研究中進行評估。

       其他靶向HER2的bpAb

       MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是基于曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的另外四種臨床階段抗HER2雙抗體。MBS301結(jié)合了曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的果糖基化半抗體，它們在工程化的CHO細胞系中單獨產(chǎn)生，并使用旋鈕入孔突變在體外異二聚化。從Fc結(jié)構(gòu)域中去除巖藻糖可增強ADCC活性，這與雙旁位靶向相結(jié)合，可在具有不同HER2水平的腫瘤細胞系以及小鼠模型中產(chǎn)生強大的活性。目前正在進行一項I期臨床研究（NCT03842085），評估MBS301治療HER2陽性復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性惡性實體瘤的效果。

       Biocad的BCD-147采用不對稱scFv-Fab構(gòu)型，并已在健康志愿者（NCT03912441）的I期研究中進行了測試。TQB2930由正大天慶藥業(yè)開發(fā)，正在研究用于HER2陽性實體瘤，作為HER2陽性乳腺癌和胃癌（NCT06115902）的裸抗體（NCT05380882）和ADC（TQB2102）。最后，玄珠生物正在開發(fā)不對稱通用液相色譜雙抗KM257，目前正在臨床研究中，用于HER2陽性實體瘤（NCT05320874）和用作HER2陽性晚期實體瘤（NCT05804864）的ADC（KM501）。

       SAR441236

       由于病毒遺傳多樣性高，識別和開發(fā)有效的HIVbnAb一直具有挑戰(zhàn)性。大分子和小分子單藥療法在很大程度上失敗了，因為選擇壓力增加了突變逃逸變異的機會。使用bnAb組合的臨床前和臨床研究顯示療效增強，證明了靶向多個表位的實用性。SAR441236由Sanofi（NCT03705169）處于I期臨床開發(fā)階段，由雙特異叉雙變量Ig樣（CODV-Ig）臂與具有第三個獨特特異性的Fab臂配對組成，使其成為三旁位bnAb。臨床前體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，在非人靈長類動物（NHP）猿猴-人類免疫缺陷病毒（SHIV）病毒攻擊模型中，三旁位bnAb在降低病毒載量和預防感染方面更有效。

       GEN3009

       Genmab將其專有的DuoBody和HexaBody技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計了GEN3009，這是一種靶向bpAb的CD37，具有增強的Fc介導的六聚化。該bpAb包含互補的Fc突變，可在體外受控的Fab-arm交換反應中指導異二聚化，并通過E430G突變增強六聚化。在B細胞淋巴瘤細胞系以及患者來源的慢性淋巴細胞白血病樣本中，與單親本mAb或組合相比，由于雙表位靶向結(jié)合增強的六聚體化，導致Fc結(jié)構(gòu)域密度的局部增加，導致CDC優(yōu)于單親本mAb。Fc結(jié)構(gòu)域聚集進一步增加了ADCC和ADCP，從而在幾種細胞系衍生的異種移植模型以及患者來源的非霍奇金淋巴瘤異種移植物中產(chǎn)生有效的抗腫瘤活性。GEN3009已在復發(fā)或難治性B細胞非霍奇金淋巴瘤（NCT04358458）患者中進行了首次人體試驗，但出于戰(zhàn)略原因，最近停止了進一步的臨床開發(fā)。

       REGN5093和REGN5093-M114

       再生元的雙旁位抗MET共LC抗體REGN5093已作為抗體（NCT04077099）和ADC（NCT04982224進入臨床。REGN5093來源于Regeneron專有的VelocImmune平臺，可有效抑制不依賴配體的MET和HGF誘導的信號傳導。再生元通過在REGN5093-M114中偶聯(lián)專有的細胞毒性美登素有效載荷，進一步利用了REGN5093的這一特性。該分子在MET依賴性和MET非依賴性腫瘤模型中均顯示出療效，進一步證明了雙旁位ADC方法的實用性。

       OriCAR-017

       Oricell的雙旁位GPRC5D靶向CAR-T細胞療法OriCAR-017已進入臨床，用于治療復發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤（NCT05016778）。與cilta-cel類似，OriCAR-017CAR包含靶向GPRC5D上兩個不同表位的串聯(lián)sdAb。作者推測，雙旁位靶向增加了其CAR-T細胞療法的特異性和親和力，從而提高了療效。報道了良好的I期安全性和有效性數(shù)據(jù)，并支持OriCAR-017的進一步開發(fā)。

       SARS-CoV-2中和bpAb

       由SARS-CoV-2引起的全球大流行刺激了世界各地的大量研究工作，多個小組展示了使用sAb等抗體片段作為bpAb構(gòu)建單元的實用性。幾項研究表明，bpAbs需要多個同步突變，從而大大降低了突變逃逸的患病率。與通常通過抑制RBD-ACE2界面僅限于傳統(tǒng)阻斷MoA的單價結(jié)合相反，順式中的bpAb結(jié)合表現(xiàn)出阻斷和構(gòu)象變化，而反式中的雙旁位結(jié)合表現(xiàn)出阻斷和多聚化。臨床上最先進的靶向bpAb的SARS-CoV-2BAT2022已完成I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一種對稱的含2+2Fc的分子，由一個與HC的C端相連的sdAb分子組成。BAT2022保持了其作為bnAb對多種SARS-CoV-2亞變體的有效性，證明了作為治療性抗體的實用性。

       ISB 1442

       Ichnos Sciences的ISB1442是一種雙特異性bpAb，基于專有的BEAT2.0（基于TCR的抗體雙特異性結(jié)合）平臺。ISB1442在一個串聯(lián)Fab臂上以高親和力結(jié)合兩個不同的CD38表位，并將其與低親和力CD47 Fab臂結(jié)合，以阻斷吞噬細胞上的信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）。低CD47親和力旨在防止對紅細胞的靶向毒性，同時在高親和力雙旁位CD38臂的熱烈引導下結(jié)合時啟用有效的抗腫瘤活性。ISB1442結(jié)合Fc突變增強效應器功能，不僅影響ADCP，還表現(xiàn)出ADCC和CDC。臨床前數(shù)據(jù)表明，與單一靶點藥物相比，這種復雜的MoA可能具有更高的療效和安全性。因此，ISB1442目前正在針對復發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤（NCT05427812）患者的1/2期臨床研究中進行評估。

       TNB-738型

       Ancora Biotech的TNB-738是一種不對稱的抗CD38bpAb，由源自Teneobio專有轉(zhuǎn)基因UniRat平臺的兩個sdAb組成，它們以高親和力與不同的CD38表位結(jié)合。TNB-738使用旋鈕插入孔突變來實現(xiàn)重鏈配對，完全沉默的IgG4Fc以消除效應器功能，并在單臂上使用惰性kappaLC和CH1以提高可制造性。目前在健康志愿者（NCT05215912）中處于I期劑量遞增階段，TNB-738通過酶抑制發(fā)揮作用。

       IMGN151

       Immunogen的下一代FRαADC緊隨其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后進入臨床（NCT05527184），該藥物于2022年獲得FDA的加速批準。IMGN151包含一個scFv臂和一個mirvetuximab Fab臂配對，每個臂都結(jié)合FRα的獨特且不重疊的表位。IMGN151的雙旁位靶向模式可促進FRα陽性細胞上的結(jié)合事件，從而在高、中和低表達FRα的細胞系中實現(xiàn)卓越的有效載荷遞送。與mirvetuximab soravtansine相比，bpAb的遞送增加與更有效的連接子有效載荷相結(jié)合，可能使IMGN151能夠解決更廣泛的患者群體。

       【NO.5】結(jié)論與展望

       bpAb由單特異性mAb的組合演變而來，已在2022年FDA批準的第一個基于bpAb的療法中證明了其臨床安全性和有效性。臨床管道中的bpAb基于多種形式，除了存在用于穩(wěn)定性和效應器功能的Fc結(jié)構(gòu)域外，沒有明顯的趨勢。最終，生物學決定了bpAb的設(shè)計。與靶向不同表位的傳統(tǒng)mAb、bsAb甚至mAb組合相比，bpAb具有獨特的MoAs，使其成為適用于不同適應癥的有吸引力的療法。雙旁原位結(jié)合所帶來的親和力可實現(xiàn)高度選擇性的腫瘤靶向，如bpAbISB1442，正如雙旁位CAR-T療法cilta-cel的臨床成功所強調(diào)的那樣，這些特性也可以使T細胞接合器或CAR-T細胞等治療方式受益。目前正在臨床上測試的大多數(shù)BPAb已被證明會影響TAA聚集，以改善受體激動性、效應子功能和/或有效的內(nèi)化和溶酶體運輸。除了治療性mAb外，這種MoA特別適合改善細胞毒性有效載荷向腫瘤的遞送，目前正在臨床上評估的6種ADC就說明了這一點?；蛘?，雙旁位結(jié)合可以通過增加結(jié)合事件來改善有效載荷遞送，如IMGN151推測的那樣。除了狂熱的結(jié)合和受體聚集外，bpAb還用于其他MoA，例如雙途徑抑制、刺激多組分靶標，或者以抗CD38bpAbTNB-738為例，將靶標鎖定在酶促失活狀態(tài)。在傳染病中，bpAb有望解鎖bnAb，這些bnAb具有更高的反應持久性，對多樣化的病毒景觀更有效，并且可以極大地限制突變逃逸變體的出現(xiàn)。該領(lǐng)域正在從雙旁生轉(zhuǎn)向三旁生，甚至更進一步，以解決一些最 具挑戰(zhàn)性的人類疾病，例如HIV和SARS-CoV-2。

       正如臨床上BPAb數(shù)量的增加所證明的那樣，BPAb在靶向治療方面具有巨大的潛力。bpAbs的當前臨床情況顯示，依賴于受體聚集的HER2靶向藥物和相關(guān)MoA濃度很高。HER2的突出性可以用曲妥珠單抗和帕妥珠單抗聯(lián)合治療的臨床先例來解釋。然而，隨著bpAb變得越來越容易獲得，新技術(shù)可以設(shè)計更復雜的架構(gòu)，我們預計bpAb靶標和適應癥的數(shù)量將大幅增加。由于其獨特的MoAs，以前在臨床上使用傳統(tǒng)抗體失敗的靶點可能會通過bpAb獲得，并且可能會出現(xiàn)特別適合bpAb的新靶點。正如SAR441236和臨床前研究所強調(diào)的那樣，三旁位或更高價結(jié)構(gòu)可以擴展觀察到的bpAb效應，甚至解鎖新的MoA。BPAb的臨床管道已得到BPAb療法的首次批準驗證，正在迅速擴大，并將激勵對這一獨特抗體類別進行更多研究，以充分利用BPAb在靶向治療中的潛力。