蛋白質(zhì)定向進(jìn)化是生物技術(shù)領(lǐng)域的重要工具，通過模擬自然進(jìn)化過程，在實(shí)驗(yàn)室中快速優(yōu)化蛋白質(zhì)功能。然而，傳統(tǒng)方法如易錯(cuò) PCR 存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、突變庫多樣性受限等問題。
近年來，基于 CRISPR-Cas 或 T7 RNA 聚合酶的突變系統(tǒng)雖取得進(jìn)展，但仍面臨突變范圍小、宿主普適性窄等挑戰(zhàn)。在非模式生物（例如嗜鹽單胞菌 Halomonas bluephagenesis）中，缺乏高效的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化工具，限制了其在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用。如何開發(fā)一種高效、高特異性、廣宿主兼容且能同時(shí)引入多種突變類型的系統(tǒng)，成為亟待解決的難題。
近日，清華大學(xué)陳國強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications 期刊發(fā)表了題為：An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo 的研究論文。
該開發(fā)了一種正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)（OTM）。該系統(tǒng)通過將三種廣宿主兼容性的噬菌體 RNA 聚合酶（MmP1/K1F/VP4）與兩種脫氨酶（PmCDA1 和 TadA 變體）巧妙融合，構(gòu)建了一個(gè)高效、模塊化的蛋白質(zhì)進(jìn)化平臺(tái)。其核心設(shè)計(jì)原理在于：RNA 聚合酶在轉(zhuǎn)錄過程中解旋 DNA 形成單鏈區(qū)，而融合的脫氨酶則能對(duì)暴露的單鏈 DNA 進(jìn)行編輯，實(shí)現(xiàn) C:G-T:A 和 A:T-G:C 類型的堿基突變。該系統(tǒng)能在短短 1 天內(nèi)完成蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化，突變效率較自發(fā)突變提升達(dá) 150 萬倍。
在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)采用 XTEN 柔性連接肽分別將胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶與噬菌體 RNA 聚合酶融合，構(gòu)建了分別能夠產(chǎn)生 C:G-T:A 和 A:T-G:C 類型堿基突變的正交轉(zhuǎn)錄突變?cè)?。同時(shí)通過添加尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）和優(yōu)化誘導(dǎo)條件，使突變效率提升 150 萬倍，而脫靶率僅增加 65 倍。
進(jìn)一步，通過將兩種脫氨酶與噬菌體 RNA 聚合酶進(jìn)行合理組合，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了能夠同時(shí)引入 C:G-T:A 和 A:T-G:C 突變的雙功能正交轉(zhuǎn)錄突變?cè)?。通過在目標(biāo)基因上下游分別插入噬菌體啟動(dòng)子，研究人員成功實(shí)現(xiàn)了突變?cè)谀繕?biāo)基因上的均勻分布，克服了單個(gè)啟動(dòng)子策略中突變偏向啟動(dòng)子近端的局限性。
此外，正交性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于不同噬菌體 RNA 聚合酶的正交轉(zhuǎn)錄突變?cè)軌蛱禺愋宰R(shí)別各自啟動(dòng)子，避免交叉干擾，從而為之后的模塊化設(shè)計(jì)提供可能。在宿主適用性方面，該系統(tǒng)在非模式生物（例如嗜鹽單胞菌 Halomonas bluephagenesis）和模式生物（例如大腸桿菌 E.coli）中均表現(xiàn)出色，解決了現(xiàn)有工具在非模式生物中效率低下的難題。
在實(shí)際應(yīng)用方面，該系統(tǒng)展現(xiàn)了強(qiáng)大的潛力。研究團(tuán)隊(duì)通過突變熒光蛋白和色素蛋白，成功獲得具有多種不同顏色的細(xì)胞；通過靶向突變細(xì)胞骨架和分裂相關(guān)蛋白，獲得了具有超長(zhǎng)桿狀、球形和其他多種形狀的工程菌株，為形態(tài)學(xué)工程改造提供新的思路；在工業(yè)應(yīng)用場(chǎng)景下，通過一輪突變進(jìn)化 σ70 全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因RpoD和賴氨酸外排蛋白 LysE，成功獲得能夠增強(qiáng) L-精氨酸耐受性和轉(zhuǎn)運(yùn)能力的突變體。
圖1. 正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、優(yōu)化與應(yīng)用
總的來說，該研究開發(fā)的正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)具有高突變效率、高特異性和低脫靶率的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際進(jìn)化過程中僅用 1 天即可完成以往需要數(shù)周才能實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)優(yōu)化過程。特別值得關(guān)注的是，該系統(tǒng)在模式和非模式生物中均展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，有效解決了現(xiàn)有工具在非模式工業(yè)菌株中應(yīng)用受限的困境。
展望未來，該技術(shù)仍有廣闊的拓展空間和應(yīng)用前景。一方面可以嘗試整合其他突變類型的脫氨酶，進(jìn)一步豐富突變庫的多樣性；另一方面可以探索該系統(tǒng)在其他非模式生物中的兼容性和適用性。在應(yīng)用層面，該突變系統(tǒng)可以應(yīng)用于加速生物制造（例如 PHA 生產(chǎn)）中關(guān)鍵酶的優(yōu)化，推動(dòng)綠色生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳國強(qiáng)教授為論文通訊作者，生命學(xué)院 2022 級(jí)博士生邵明威為本論文第一作者。其他作者還包括陳國強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的科研助理張忠楠，博士后金曉帆和2023級(jí)博士生丁軍。相關(guān)工作獲得了國家自然科學(xué)基金和清華北大生命聯(lián)合中心的基金支持。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-61354-4
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