摘要：siRNA治療方法已獲得廣泛關注，目前已有六種siRNA獲準用于臨床應用。盡管它們被研究用于治療代謝、心血管、傳染性和罕見遺傳疾病，以及癌癥和中樞神經系統（CNS）疾病，但依然存在幾個藥物可用性挑戰(zhàn)。在這里，我們提供有關這些挑戰(zhàn)的深入討論，包括靶向積累和細胞攝取（'進入'）、內溶酶體逃逸（'逃逸'）以及體內藥效表現（'療效'）--這三個'E'挑戰(zhàn)，同時也闡明siRNA藥物開發(fā)。此外，我們提出幾種有前景的策略，這些策略在促進siRNA治療藥物臨床轉化方面具有巨大潛力，包括探索多樣的配體-siRNA結合物、擴大潛在疾病靶點，以及開掘新的修飾幾何形狀，以及開發(fā)組合療法。

       文章亮點：

       1.理論上，siRNA能夠靶向任何感興趣的基因，潛在地解決那些對小分子和蛋白質而言'無法藥物化'的疾病靶標。

       2.目前，已有六種siRNA治療藥物獲得臨床使用批準，以及大約20種其他候選藥物已進入臨床研究的后期階段。

       3.靶向累積和細胞攝?。ㄟM入）、內溶酶體逃逸（逃避）以及體內藥理學性能（療效）（三個'E'挑戰(zhàn)）是siRNA藥物開發(fā)中最關鍵的瓶頸。

       4.配體綴合的siRNA是有前景的平臺，已經在強健的肝外遞送方面取得了突破。復雜且適當的化學修飾可能會在siRNA方式的穩(wěn)定性和長期療效方面帶來驚人的突破。

       【NO.1】siRNA治療的蓬勃發(fā)展

       從制藥歷史的角度來看，小分子藥物作為最早開發(fā)和應用的治療方式，享用了超過一個世紀的使用，而蛋白質和抗體相對較晚出現，并且研究了將近半個世紀。盡管核酸分子作為一種新型治療方法的發(fā)展時間較短（20-30年），但它們已經引起了制藥行業(yè)的顯著全球關注，成為第三種最顯著的治療方式。核酸藥物仍在快速探索和開發(fā)中，特別是在RNAi領域，其廣泛而深遠的治療潛力日益顯現。考慮到這一點，我們相信即將到來的時期將是核酸的一個關鍵時代，既擴大了治療選擇的范圍，也為該領域提供了新可能性。

       與傳統的小分子藥物和抗體相比，siRNA（見詞匯表）具有豐富的疾病靶點、高開發(fā)成功率、短開發(fā)時間、強大且持久的療效，以及平臺化模式的卓越特征。目前，六種siRNA藥物（patisiran、givosiran、lumasiran、inclisiran、vutrisiran和Rivfloza）已成功商業(yè)化。盡管siRNA藥物在臨床實踐中的應用前景廣泛，但其開發(fā)面臨關鍵挑戰(zhàn)，包括靶向積累和細胞攝?。ㄟM入）、內溶酶體逃逸（逃逸）和體內藥效（療效）（三大"E"挑戰(zhàn)）。在本文中，我們闡述了siRNA治療的當前狀態(tài)和未來前景，概括了該領域所遇到的關鍵挑戰(zhàn)，并提出了一系列應對策略。通過提供廣泛的見解和靈感，本文旨在為科學和制藥界提供有價值的指導。

       【NO.2】siRNA療法的最新研究和開發(fā)狀態(tài)

       近年來，siRNA療法在多個候選藥物的前臨床和臨床研究開發(fā)中顯示出了巨大的潛力。截至2023年8月，全球范圍內有15種在臨床二期或后期階段的研究siRNA藥物（表1），涵蓋廣泛的治療領域，包括罕見疾病和遺傳性疾病，并擴展到常見疾病。主要制藥公司已擴大其研究重點，以涵蓋代謝性疾病、心血管疾病、乙型肝炎和癌癥等常見病。例如，ALN-AGT（NCT04936035i，NCT05103332ii，隨機）目前正在開發(fā)中，用于治療高血壓，并已進入二期臨床試驗。Olpasiran（NCT05581303iii，隨機）旨在治療動脈粥樣硬化斑塊，正在進行三期研究。SLN360（NCT05537571iv，隨機）是一種降脂siRNA，已進入二期研究。RBD1016（NCT05961098v，隨機）是一種用于治療乙型肝炎的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）結合siRNA，將在歐洲開始二期試驗。STP705和STP707由兩種siRNA組成，靶向轉化生長因子β1（TGF-β1）和環(huán)氧合酶2（COX-2），并以肽納米粒（PNPs）形式制備。STP705局部施用到病變組織中，以治療原位鱗狀細胞癌（isSCC）（NCT04844983vi，二期，隨機）和基底細胞癌（BCC）（NCT04669808vii，二期，非隨機），而STP707（NCT05037149viii，一期，非隨機）則通過靜脈注射到身體中，用于治療幾種實體瘤和纖維化肝病，例如原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）。

       表1.選定的商業(yè)化或晚期研究的siRNA療法

       從產品管道的角度來看，siRNA療法的一個顯著突破在于其擴展到肝外疾病，包括小分子藥物和抗體藥物一直未能涉足的領域，如中樞神經系統疾病。ALN-APP（NCT05231785ix，第一階段，隨機）是一種經椎管內給藥的siRNA，靶向淀粉樣前體蛋白（APPs），用于治療阿爾茨海默病（AD）和腦淀粉樣血管?。–AA）。最近，ALN-APP的第一階段研究在單藥劑量遞增試驗中獲得了積極的中期結果。ARO-SOD1（NCT05949294xi，第一階段，隨機）是一種針對中樞神經系統內超氧化物歧化酶1（SOD1）的研究性siRNA，可能用于治療由SOD1突變引起的肌萎縮側索硬化癥（ALS），目前正在進行第一階段研究。此外，臨床開發(fā)的RNAi療法正在向將siRNA遞送到其他組織（如眼睛、肌肉、肺部和脂肪）邁進。Tivanisiran（SYL1001）（NCT03108664xii，NCT04819269xiii，隨機）目前正在進行第三階段臨床研究，以治療干眼癥。ARO-DUX4（第一/第二階段）用于治療面肩肱肌營養(yǎng)不良（FSHD）已提交臨床試驗。ARO-MUC5AC（NCT05292950xv，第一階段，隨機）、ARO-RAGE（NCT05276570xvi，第一階段，隨機）和ARO-MMP7（NCT05537025xvii，第一/二a階段，隨機）目前正在研究用于治療肺部疾病。

       值得注意的是，siRNA的給藥頻率已經實現了歷史性的突破。siRNA的增強穩(wěn)定性修飾使其能夠在體內持久抑制基因和治療效果，同時避免潛在的序列依賴性非特異性效果。例如，Leqvio在頭三個月只需給藥兩次，隨后每六個月治療一次，以有效管理原發(fā)性高膽固醇血癥或混合性脂質異常。

       目前，全球有超過100家公司從事siRNA領域，其中大約30家公司專注于siRNA藥物開發(fā)。根據Informa Pharma Intelligence的生物追蹤記錄，目前大約有200種基于siRNA/RNAi的藥物正在進行臨床前和臨床研究。自2016年以來，共有14種siRNA和反義寡核苷酸（ASO）獲得批準商業(yè)化。此外，寡核苷酸治療領域在并購方面也見證了顯著活動。近年來，在心血管和代謝疾病、神經系統疾病和乙型肝炎等領域有一些值得注意的許可協議。代表性的siRNA遞送平臺包括脂質納米顆粒（LNP）、GalNAc-siRNA偶聯物（GalAheadTM、PDoV-GalNAc等）、GEMINI、?TRiM?、PNP、RIBO-GalSTAR?和RIBO-OncoSTAR，而IKARIA?的建立是為了開發(fā)長效siRNA。

       【NO.3】siRNA臨床研究的瓶頸

       盡管siRNA藥物研究取得了重大進展，但仍存在一些需要克服的關鍵挑戰(zhàn)。具體來說，三個"E"挑戰(zhàn)（進入、逃逸、療效）是限制siRNA臨床翻譯和應用的三個關鍵問題。

       圖1.限制siRNA臨床翻譯和應用的三個"E"挑戰(zhàn)

       3.1進入挑戰(zhàn)：靶向積累和細胞攝取

       第一個挑戰(zhàn)是在靶器官/組織中實現siRNA的高效富集并有效內化到靶細胞中（圖1A）。由于它們的大尺寸和陰離子電荷，未修飾的裸siRNA顯示出低生物利用度，半衰期短至幾分鐘。納米載體封裝的siRNA通常與血清蛋白結合，導致網狀上皮系統（RES）攝取和吞噬清除。此外，siRNA可被血漿、組織和細胞質中存在的核酸酶或磷酸酶快速降解。全身清除后，siRNA必須穿過毛細血管的內皮才能進入組織，由于廣泛的粘附和緊密連接，這尤其具有挑戰(zhàn)性。盡管siRNA可能被動地積累在肝臟或腫瘤組織等多孔部位，但將這些治療劑輸送到優(yōu)先吸收這些分子的器官以外的身體其他部位，以及血液-腦屏障（BBB）和血液-視網膜屏障等屏障的有效穿越，仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。

       3.2逃逸激發(fā)試驗：內體和溶酶體逃逸

       第二個挑戰(zhàn)是如何實現有效的內體和溶酶體逃逸。雖然siRNA可以通過內吞作用進入細胞，但只有不到1%的siRNA可以從內吞作用中逃逸，被動siRNA逃逸率低于0.01%。去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）是一個明顯的例外，其肝細胞表達水平約為500000或更高，循環(huán)時間不到20分鐘。足夠的GalNAc-siRNA偶聯物可以在肝細胞的細胞質中積累，以在治療期間達到治療水平。雖然這為未來基于RNAi的肝臟治療靶向帶來了希望，但siRNA逃逸對于其他類型的細胞來說仍然是一個未解決的問題。大多數表面受體的表達范圍為10000-100000或更短，受體回收時間大約或超過90分鐘（圖1B）。由于細胞質和內體中siRNA的降解，觀察到在任何給定時刻，只有極小的內吞GalNAc-siRNA偶聯物存在于體內細胞質中。值得注意的是，雖然內體包埋的RNA治療藥物起到了作用，從而維持了較長的單劑量反應持續(xù)時間，但這一優(yōu)勢被很大一部分無法穿透細胞質的內吞RNA治療藥物所抵消。因此，雖然內體的釋放確實是抑制RNA療法在人類疾病治療中更廣泛應用的主要障礙，但值得注意的是，需要有一種平衡，以在一定程度上維持貯存效應，確保長時間的持續(xù)反應。

       迄今為止，試圖使用改良的pH敏感性、離子穿透劑、氯喹樣溶酶體試劑、成孔肽如蜂毒肽、十二烷基磷酸膽堿（DPC）和/或GalNAc偶聯的蜂毒肽樣肽（NAG-MLP）來增強內體逃逸，但尚未完全解決細胞毒性與內體逃逸增加之間的關系。

       3.3療效挑戰(zhàn)：體內藥物性能

       第三個挑戰(zhàn)是要求良好的體內穩(wěn)定性、持久效果和安全性。使用病毒載體進行體內核酸遞送有一些毒副作用和目前主要限于臨床前研究?；瘜W合成的載體系統，如陽離子脂質和大多數無機納米顆粒，可在體內誘導細胞凋亡和炎癥。給藥系統還必須確保生產、質量控制和運輸的便利性，以實現大規(guī)模臨床應用。此外，目前RNA藥物臨床前研究中廣泛使用的小鼠模型并不是毒性評價模型，因為從小鼠模型獲得的RNA劑量反應關系不能直接應用于人類。非靈長類動物模型通常缺乏與人類的基因組序列的足夠重疊來預測藥效學效應，因此有必要擴大非人靈長類動物（NHP）模型的使用，或者作為潛在的選擇，擴大與疾病相關的類器官的使用。未經修飾的寡核苷酸通常在體內不穩(wěn)定，并且很容易被血液中的核酸酶降解。此外，外源寡核苷酸可能在體內顯示免疫原性并引起免疫反應。隨著技術的突破，化學修飾【例如，對硫代磷酸鹽（PS）骨架、核糖和鏈末端的修飾】已被廣泛用于增強siRNA的穩(wěn)定性，減少/消除脫靶效應和免疫原性，從而提高siRNA的"功效"（圖1C）。通過復雜的修飾，siRNA已成功實現99%的基因沉默并在體內持續(xù)存在，允許低劑量季度、半年甚至每年給藥?；瘜W修飾的進化史及其對siRNA功效的影響是一個令人著迷的研究領域，值得進一步全面探索。

       然而，盡管取得了這些可喜的成就，但仍存在一些挑戰(zhàn)。例如，修飾誘導的穩(wěn)定性和特異性增強可能會降低沉默活性或引起意想不到的不良反應（圖1D）。此外，在臨床前和臨床研究中，都需要仔細評估siRNA的免疫原性和毒性（包括脫靶誘導毒性）。更重要的是，一系列專利家族對siRNA藥物開發(fā)的知識產權格局做出了重大貢獻。例如，WO2016028649概述了一種幾何結構，該幾何結構將siRNA的兩條鏈的修飾劃分為由核苷酸計數的特定范圍定義的不同區(qū)域，從而提供每個區(qū)域的修飾單體的化學結構或物理化學性質。WO2013074974描述了一種dsRNA雙鏈體，其基序由一條或兩條鏈中三個連續(xù)核苷酸上的三個相同修飾組成，特別是在切割位點附近。此外，WO2018185241重點介紹了反義鏈5'端2位和14位核苷酸的修飾策略，以及正義鏈上的核苷酸，對應于反義鏈的11、13、11和13或11-13位。這些專利對siRNA藥物開發(fā)構成了重大障礙，必然需要該領域的其他實體建立獨特的技術。

       【NO.4】克服三個"E"挑戰(zhàn)的有前途的策略

       為了應對這些挑戰(zhàn)并推動siRNA療法的發(fā)展，幾種有前途的策略或方法值得探索。

       圖2.克服三個"E"挑戰(zhàn)的有前途的方法

       4.1開發(fā)新型化學修飾

       優(yōu)化化學修飾是提高siRNA穩(wěn)定性、特異性、安全性和生物利用度的重要方向。這包括開發(fā)新的化學修飾單體、修飾模式和RNAi觸發(fā)結構（圖2A-C）。傳統的siRNA修飾主要涉及2′-O-甲基化（2′-OMe）、2′-氟脫氧核糖核苷酸（2′-F）和PS，而新型修飾單體和修飾模式的開發(fā)將進一步完善siRNA的藥代動力學和安全性。例如，已經開發(fā)了新型單體，如乙二醇核酸（GNA）和5′-（E）-乙烯基膦酸鹽[5′-（E）-VP]（圖2B），新型修飾模式，如增強穩(wěn)定化學（ESC）plus（ESC+）（圖2A），以及新型RNAi觸發(fā)結構，如小環(huán)狀干擾RNA（sciRNA）、不對稱siRNA和二價siRNA支架（圖2C）。此外，現在可以使用算法實現siRNA的設計和修飾。例如，Alnylam已經開發(fā)了幾代siRNA設計，包括部分修飾的標準模板化學（STC）、ESC、高級ESC、ESC+和IKARIA?。

       幾種ESC+偶聯物目前正處于臨床流程中。在專利方面，新型單體、圖案和結構的發(fā)展可以為新來者提供繞過現有知識產權的空間。此外，業(yè)務合作期間的開放許可協議可以為其他公司提供使用siRNA技術的機會，促進其普及和商業(yè)化。

       4.2建立獨特的遞送系統

       雖然LNP、聚合物、無機納米顆粒和外泌體等各種納米材料已被開發(fā)為siRNA載體，但它們的負載能力、穩(wěn)定性、安全性和有效性仍然存在局限性。未來的基礎研究應側重于優(yōu)化這些載體的物理化學性質，并使用獨特的靶向配體或化學部分特異性結合患病細胞的表面標志物/受體。siRNA可以與配體共價連接以形成配體-siRNA偶聯物，這可以降低循環(huán)中的清除率并增強靶向積累和細胞攝取，從而調節(jié)其藥代動力學和藥效學特征。這些配體包括小分子、脂質[如膽固醇、2′-O-十六烷基（C16）、各種脂肪酸]、肽（如RGD衍生物、H2009.1、A20FMDV2、胱氨酸結肽）、適配體、抗體、蛋白質（如centyrin）、糖類（如GalNAc）和非編碼RNA（ncRNA）（圖2D）。

       與納米顆粒相比，配體偶聯物通常體積小，易于大規(guī)模合成，并具有明顯的藥代動力學特性。與脂肪酸等脂質部分結合可以改變肝外組織中的積累，從而能夠在包括CNS、心臟、肺和肌肉在內的多種組織中進行基因調控?？贵w和細胞表面受體之間的特異性相互作用可能能夠遞送到其他技術無法到達的特定組織和/或細胞亞群。單劑量的TfR1抗體（αTfR1）與siRNA偶聯，在小鼠和猴子中產生超過75%的mRNA減少，骨骼肌和心臟（橫紋）肌的沉默最嚴重，而其他主要器官的沉默活動最少或沒有。siRNA治療藥物還可以與陽離子肽部分（如細胞穿透肽和Endo-Porter）連接，有效穿透組織屏障和細胞膜。此外，siRNA和內體逃逸增強佐劑的組合可能是將配體偶聯的siRNA遞送至非肝組織的可行策略。

       4.3擴大疾病目標

       siRNA技術主要用于目標蛋白質編碼基因。然而，最近的研究表明，ncRNA，如長ncRNA（lncRNA），在各種疾病中起著重要作用（圖2E）。因此，開發(fā)能夠有效調節(jié)ncRNA表達的新型RNA靶向技術可能為疾病治療提供更廣泛的機會。此外，探索編碼和ncRNA之間的相互作用，例如競爭性內源性RNA（ceRNA）網絡，可能會為疾病機制提供新的見解，并實現更有效的治療干預。除了在mRNA水平調節(jié)基因表達外，siRNA技術還可以靶向表觀遺傳修飾，例如DNA甲基化或組蛋白修飾，這些修飾在疾病的發(fā)展和發(fā)展中起著至關重要的作用。通過調節(jié)表觀遺傳標記，有可能重編程基因表達模式并逆轉疾病表型。

       4.4探索聯合療法

       利用雙靶向方法或將siRNA與其他治療藥物（如化療藥物、抗體或免疫調節(jié)劑）聯合使用，有望增強療效、克服耐藥性和減少脫靶效應。這些策略可能為治療以前無法治愈的疾病創(chuàng)造新的機會。例如，正在實施一種涉及VIR-2218（GalNAc-siRNA偶聯物，也稱為ALNHBV02）和聚乙二醇-干擾素α(PEG-IFN-α)的聯合治療，旨在實現乙型肝炎的功能性治愈。siRNAJNJ-73763989（JNJ-3989）加核苷（t）類似物（NA）用于評估有/沒有衣殼組裝調節(jié)劑JNJ-56136379（JNJ-6379）的慢性乙型肝炎患者的治療效果。此外，pozelimab（補體C5靶向抗體）和cemdisiran（一種GalNAc-siRNA偶聯物）正在聯合用于治療重癥肌無力和陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）。此外，正在進行Empaveli（一種環(huán)肽）和siRNA組合的臨床前研究，這可能會降低Empaveli的治療頻率和/或提高治療效果。

       【NO.5】總結和未來展望

       我們正在見證RNA藥物治療新時代的到來。RNA療法基于一個強大且多功能的平臺，該平臺在解決未滿足的臨床需求方面具有幾乎無限的潛力。因此，RNA療法注定會改變許多疾病的護理標準。隨著第六種siRNA藥物Rivfloza的獲批，未來幾年肯定會有更多的siRNA療法出現。在成功建立用于肝細胞遞送的最先進的GalNAc-siRNA偶聯物后，肝外遞送技術的探索將成為該領域的下一個前沿領域（參見臨床醫(yī)生專區(qū)）。

       與肝臟相比，將RNAi分子遞送到靶向非肝臟疾病的挑戰(zhàn)要大得多。配體-siRNA偶聯物必須以足夠的速率在靶細胞中積累以實現沉默。此外，避免同時進行腎臟和網狀內皮清除、增強外滲和組織滲透、增加貨物內化受體低表達細胞類型的攝取、改善內體逃逸以及支持強效和安全治療效果等幾個因素需要進行珠子處理以實現令人滿意的沉默。為了將siRNA的適用性擴大到肝臟組織之外，至關重要的是：（i）識別或確定可以促進有效內化的獨特受體;（ii）提出具體的篩選或勘探策略;（iii）設計并鑒定用于穩(wěn)健遞送和持續(xù)基因沉默的新型配體;（iv）選擇與特定疾病有關的遺傳或臨床可行的靶基因。如果在臨床條件下肝外遞送變得可行且穩(wěn)健，則狩獵RNAi療法的領域可能會顯著擴大。

       此外，在siRNA的開發(fā)中，與化學制造和控制（CMC）以及藥物注冊政策相關的問題會顯著影響新藥營銷。siRNA的CMC面臨多重挑戰(zhàn)，包括單體供應、質量控制、能力建設、雜質表征和分離純化。在藥品注冊政策方面，目前還缺乏統一的國際標準。建議通過加強科學研究、提高透明度以及修訂法規(guī)和政策來確保臨床試驗的安全性和有效性。

       此外，目前siRNA的主要擴展方向是在慢性疾病領域，如高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、高血壓、高脂蛋白膽固醇（a）[Lp（a）]心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和乙型肝炎。未來siRNA藥物開發(fā)的突破性方向包括遞送至CNS、眼睛、肌肉、肺和脂肪組織和腫瘤。這為siRNA治療留下了相當大的市場空間。

       盡管存在挑戰(zhàn)（參見懸而未決的問題），但siRNA代表了一種有前途的方式，有可能徹底改變各種疾病的治療。為了應對與高效和安全遞送、內體逃逸、體內功效相關的挑戰(zhàn)，其他方面則需要跨多個領域的持續(xù)創(chuàng)新和合作?？梢钥隙ǖ氖?，經過不懈的努力，這些挑戰(zhàn)將繼續(xù)被規(guī)避，并最終迎來進一步的重大突破。