2017年8月，諾華的CAR-T藥物Kymriah獲FDA批準(zhǔn)，用于治療復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病，完全緩解率達(dá)83%，首次實現(xiàn)"活細(xì)胞藥物"商業(yè)化。

       截至目前，全球獲批的細(xì)胞療法一共有42種，其中免疫細(xì)胞療法15種，干細(xì)胞療法27種。

       盡管細(xì)胞療法，特別是CAR-T，無論在臨床還是商業(yè)化上都取得了相當(dāng)?shù)某晒?，但由于高昂的價格、復(fù)雜的生產(chǎn)工藝、使用的不便宜性，限制了其在更大范圍的應(yīng)用。

       當(dāng)自體CAR-T在血液瘤治療上取得重大突破后，業(yè)內(nèi)立即將目光投向了異體通用型CAR-T。但患者對于異體CAR-T的免疫排斥（HvG）始終是困擾業(yè)界的一大難題。至今，除了邦耀通過多基因編輯產(chǎn)生的通用型CAR-T（TyU19）在自免疾病患者治療上取得一定突破外，其它公司尚未在臨床上取得實質(zhì)性突破。

       近幾年，通過將CAR-T基因直接遞送到患者體內(nèi)并表達(dá)在T細(xì)胞表面的In vivo CAR-T技術(shù)正悄然興起，而這些技術(shù)的領(lǐng)導(dǎo)者主要是歐美的初創(chuàng)型Biotech（表1），其中已有多家被MNC看中，或合作或被收購。國內(nèi)方面，博生吉、沙礫、易慕峰、云頂新耀等企業(yè)也已做了深入布局。

       表1. 不同In vivo CAR-T公司列表

       從技術(shù)上來看，目前的In vivo CAR-T按遞送方式可以分為病毒及納米顆粒兩大類（表1）。

       其中病毒遞送又以慢病毒為主，已有多款I(lǐng)n vivo CAR-T進(jìn)入臨床試驗。近日，EsoBiotec公布了其ESO-T01（圖1）的臨床1期試驗早期數(shù)據(jù)。

       圖1. ESO-T01結(jié)構(gòu)示意圖

       首批4位患者在療效方面，1例患者在輸注后第28天骨髓中的腫瘤病灶和惡性血細(xì)胞完全消失，另1例患者在治療后兩個月達(dá)到相同效果。其余2例患者獲得部分緩解，表現(xiàn)為病灶縮小和癌細(xì)胞減少。安全性數(shù)據(jù)顯示，4例患者接受單次ESO-T01輸注后均出現(xiàn)不同程度不良反應(yīng)：所有患者在輸注當(dāng)日均出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱等急性炎癥反應(yīng)，其中3例出現(xiàn)需藥物干預(yù)的低血壓癥狀。

       慢病毒遞送CAR-T的優(yōu)勢在于：1）將CAR基因整合至宿主T細(xì)胞基因組中，保障CAR蛋白長期穩(wěn)定表達(dá)，使CAR-T細(xì)胞能夠持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用，達(dá)到傳統(tǒng)CAR-T的效果。2）相比γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂細(xì)胞，慢病毒可有效感染處于靜止期的T細(xì)胞，適用于T細(xì)胞早期狀態(tài)，能夠?qū)Ω嗟腡細(xì)胞進(jìn)行改造，提高治療效果。3）能攜帶約8kb外源序列，適合構(gòu)建多靶點、裝甲化CAR結(jié)構(gòu)，為CAR-T細(xì)胞的設(shè)計和功能多樣化提供了更多的可能性。

       但其缺點也比較明顯：1）慢病毒本身具有一定的免疫原性，可能會引發(fā)機體的免疫反應(yīng)。一方面，患者體內(nèi)可能預(yù)先存在針對慢病毒的中和抗體，這會降低病毒載體的感染效率，影響CAR-T細(xì)胞的生成；另一方面，免疫反應(yīng)可能會導(dǎo)致炎癥等不良反應(yīng)，影響治療的安全性和有效性。2）慢病毒的隨機整合可能會導(dǎo)致插入突變，干擾宿主基因組的穩(wěn)定性，增加繼發(fā)性腫瘤發(fā)生的幾率。3）慢病毒載體的生產(chǎn)需要專業(yè)的技術(shù)和設(shè)備，生產(chǎn)過程較為復(fù)雜，包括病毒顆粒的包裝、純化等環(huán)節(jié)，對生產(chǎn)環(huán)境和質(zhì)量控制要求很高，這使得慢病毒體內(nèi)CAR-T療法的生產(chǎn)成本較高。

       而使用納米顆粒，特別是脂質(zhì)納米顆粒（LNP），作為遞送載體的技術(shù)方式相較于慢病毒具有一定優(yōu)勢：1）LNP遞送的mRNA不整合基因組，僅短暫表達(dá)（數(shù)天至1周），可避免長期毒性，如插入突變、持續(xù)免疫激活等。此外，可多次給藥調(diào)節(jié)療效，能減少細(xì)胞因子風(fēng)暴的風(fēng)險。2）LNP作為已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)的遞送系統(tǒng)，可標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，不依賴于細(xì)胞體系，便于放大。3）LNP的脂類化合物具有良好的生物相容性，其表面的PEG修飾脂質(zhì)可阻礙單核巨噬細(xì)胞的攝取和血清蛋白的黏附，減少免疫原性，有助于減少非特異性免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)更精準(zhǔn)的抗原特異性免疫應(yīng)答。4）LNP的降解產(chǎn)物為無毒的小分子物質(zhì)，能夠通過代謝途徑排出體外，確保了其在體內(nèi)的安全性。

       因此，我們可以把利用LNP作為載體通過靶向免疫細(xì)胞遞送CAR-T mRNA的藥物（tLNP）看作是一種大分子藥物，甚至是一種ADC藥物，而這類ADC的Payload就是包含mRNA的LNP。

       目前tLNP比較有代表性的產(chǎn)品有Capstan的CPTX2309及NanoCell的NCtx-CD19（圖2）。

       圖2. （A）CPTX2309；（B）NCtx-CD19結(jié)構(gòu)示意圖

       tLNP作為一種ADC，可以拆解為三個主要元件：1）抗體；2）LNP；3）mRNA。而這三個元件的設(shè)計、優(yōu)化及組合將決定產(chǎn)品能否取得臨床及商業(yè)化成功。

       1、抗體

       如果靶向T細(xì)胞，可供選擇的抗體靶點包括CD3、CD5、CD7、CD8、TCR等。而這些靶點如何組合？抗體如何選擇親和力及Epitope?抗體選擇什么樣的Format（IgG、VHH、scFv、Fab等）？這些設(shè)計將決定tLNP的靶向特異性及T細(xì)胞激活的強度及持久性，也在一定程度決定了藥物的療效及安全性。

       2、LNP

       傳統(tǒng)LNP最大的局限是易于在肝臟聚集，主要原因是LNP的脂質(zhì)組成及表面電荷使其吸附血液中的脂蛋白與肝臟中的脂蛋白受體結(jié)合而聚集。

       LNP由四種成分組成：1）陽離子脂質(zhì)；2）磷脂；3）膽固醇；4）PEG-脂質(zhì)（圖3）。

       圖3. LNP結(jié)構(gòu)示意圖

       其中，陽離子脂質(zhì)是LNP遞送系統(tǒng)中最關(guān)鍵的組分，決定了遞送效率和轉(zhuǎn)染效率。膽固醇在LNP中起到穩(wěn)定納米顆粒結(jié)構(gòu)、促進(jìn)mRNA胞內(nèi)攝入和胞質(zhì)進(jìn)入的作用。磷脂有助于mRNA的封裝、穩(wěn)定脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)、提高mRNA遞送效率。PEG-脂質(zhì)可以提高納米顆粒的整體穩(wěn)定性，延長納米顆粒在血液中的代謝時間。

       通過調(diào)整脂質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)、成分及劑型來優(yōu)化LNP，降低其肝臟靶向性并對富含T細(xì)胞的脾臟（或其它免疫組織）具有更好的靶向性，同時增強血液穩(wěn)定性，是tLNP的主要研究目標(biāo)。

       Capstan的創(chuàng)始人之一，美國賓大的Michael J. Mitchell教授團(tuán)隊，通過合成252種含硅氧烷的類脂質(zhì)，發(fā)現(xiàn)負(fù)電荷脂質(zhì)能增強脾臟遞送。從Capstan已公開的專利來看，CICL-1（US20230320095A）和CICL-207（US2025127728A1）兩款陽離子脂質(zhì)對脾臟有較好的靶向性（圖4）。

       圖4. CICL-1及CICL-207結(jié)構(gòu)示意圖

       此外，在Capstan專利（WO2023196445及WO2024249954）中分別對PEG-脂質(zhì)進(jìn)行改造修飾以提高轉(zhuǎn)染效率及連接CD47多肽，從而降低巨噬細(xì)胞的識別以提高生物利用度。

       另外，LNP的粒徑影響其內(nèi)化、生物分布、免疫原性、降解和清除，通常LNP的最佳粒徑范圍為20-200nm。通過優(yōu)化LNP各組分的比例和種類，可提高LNP的穩(wěn)定性和對mRNA的保護(hù)作用。

       因此，對于LNP脂化學(xué)結(jié)構(gòu)及制劑的不斷優(yōu)化改造將是未來tLNP主要研發(fā)方向之一，也將是各家公司不同產(chǎn)品的主要差異化點。

       3、mRNA

       作為遞送入細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的mRNA，面臨穩(wěn)定性、免疫原性及轉(zhuǎn)染效率等諸多挑戰(zhàn)。

       多年研究發(fā)現(xiàn)，可以通過用人工合成的非天然核糖核酸替換天然核糖核酸來合成mRNA，如使用假尿嘧啶核苷（Ψ）替代尿嘧啶核苷，可減少模式識別受體（PRRs）的激活，降低免疫反應(yīng)，增強mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性。

       用常見密碼子替換稀有密碼子可以增加mRNA翻譯水平，提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。增加GC含量也可以提高mRNA翻譯水平并降低免疫原性。

       5'帽結(jié)構(gòu)是mRNA翻譯和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的重要識別位點，其完整性對mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要。3'多聚A尾的縮短會導(dǎo)致mRNA降解速率加快，因此要保證3'多聚A尾的完整性和適當(dāng)長度。

       在5′UTR之后引入Kozak共識序列可提高穩(wěn)定性和翻譯起始水平。選擇人α珠蛋白和β珠蛋白3′UTR序列可顯著提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。在編碼序列和多聚A尾部之間以頭尾方式引入兩個β珠蛋白的3′UTR序列，能進(jìn)一步提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。

       而NanoCell等公司選用的環(huán)狀RNA既無5'帽結(jié)構(gòu)也無3'多聚A尾，在穩(wěn)定性、免疫原性、生產(chǎn)成本等方面相較于傳統(tǒng)線性mRNA具有一定優(yōu)勢，但在環(huán)化效率、純化、表達(dá)調(diào)控等方面仍具挑戰(zhàn)（圖5）。

       圖5. 線性及環(huán)狀mRNA對比

       隨著tLNP CAR-T陸續(xù)進(jìn)入臨床，這種In vivo CAR-T技術(shù)將面臨有效性、安全性及持久性的考驗。如何優(yōu)化T細(xì)胞靶向特異性？如何找到合適的轉(zhuǎn)染效率？如何降低免疫原性？如何確定合適的給藥劑量及給藥周期以實現(xiàn)長期藥效？與傳統(tǒng)CAR-T相比，In vivo CAR-T的胞內(nèi)共刺激信號是否需要進(jìn)一步優(yōu)化？等等，這些問題將是tLNP產(chǎn)品不斷優(yōu)化并在臨床上取得驗證的重要方向。

       tLNP作為一種顛覆性技術(shù)，一旦在臨床上取得突破，將意味著細(xì)胞治療進(jìn)入大分子藥物時代。