抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的設(shè)計(jì)需要綜合考慮抗體、連接子、小分子毒素三個(gè)組成成分及它們之間的合理組合。其中抗體的選擇是 ADC 設(shè)計(jì)的起點(diǎn)，連接子與連接技術(shù)是決定 ADC 成藥性的關(guān)鍵因素，小分子藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞應(yīng)具有高效的殺傷作用。ADC 藥物的設(shè)計(jì)也一直圍繞著這三部分不斷發(fā)展。ADC 藥物的工藝包括了小分子的制備和抗體的制備，ADC 分析也相較于傳統(tǒng)生物制藥分析更為復(fù)雜，需要多種生物制藥研究和分析方法聯(lián)合使用。

       今天為大家解讀一篇關(guān)于ADC藥物的CMC與表征概述的文章。主要圍繞第一代ADC藥物進(jìn)行闡述，通過了解第一代ADC的開發(fā)可以讓我們站在巨人的肩膀上為新一代ADC研發(fā)提供思路。

       1.1 簡(jiǎn)介

       ADC從工藝和分析開發(fā)的角度來看，其技術(shù)體系極為復(fù)雜。ADC通過規(guī)避細(xì)胞毒性的方式實(shí)現(xiàn)高效活性成分的靶向遞送，相比其單個(gè)分子組分能提供更優(yōu)越的治療指數(shù)，正成為該領(lǐng)域新興的解決方案。ADC產(chǎn)品的質(zhì)量與性能直接取決于生產(chǎn)工藝及其設(shè)計(jì)控制方式。本章將重點(diǎn)闡述第一代ADC的工藝開發(fā)，以及這些工藝在新一代ADC中的延伸應(yīng)用。

       1.2 ADC生產(chǎn)工藝

       ADC的開發(fā)從充分表征的單克隆抗體（mAb）、連接子及細(xì)胞毒素原料開始，依次經(jīng)歷mAb活化、偶聯(lián)、純化、制劑及臨床給藥儲(chǔ)存等步驟。圖1.1概括了第一代ADC產(chǎn)品的通用生產(chǎn)工藝流程。在整個(gè)過程中，ADC各組分（抗體、毒素和連接子）均會(huì)經(jīng)歷嚴(yán)苛的化學(xué)與物理環(huán)境（條件），這些條件有可能影響產(chǎn)品質(zhì)量，應(yīng)進(jìn)行充分的控制。關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs，見表1.1）是ADC工藝的核心概念，需在整個(gè)流程中進(jìn)行全面監(jiān)控以確保終產(chǎn)品的高質(zhì)量。監(jiān)控CQAs的目的是根據(jù)質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況（QTPP）要求--包括安全性和有效性等特性--確保產(chǎn)品達(dá)到既定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

       圖1.1 ADC的制造流程概覽

       表1.1 ADC關(guān)鍵質(zhì)量屬性（控制階段和影響）

       1.2.1 偶聯(lián)

       ADC的生產(chǎn)始于化學(xué)與生物起始原料，首先抗體與小分子偶聯(lián)生成ADC原液。從工藝規(guī)模來看，正是這一偶聯(lián)工藝環(huán)節(jié)使ADC產(chǎn)品開發(fā)既不同于單抗藥物，也區(qū)別于小分子藥物開發(fā)。該步驟需在支持活性化學(xué)反應(yīng)條件下進(jìn)行，既要實(shí)現(xiàn)單抗的適度偶聯(lián)，又要避免起始原料發(fā)生顯著降解或交叉反應(yīng)。

       在進(jìn)入偶聯(lián)階段前，ADC工藝中的連接子、細(xì)胞毒素有效載荷和單抗中間體的生產(chǎn)與控制要求存在顯著差異。此外，完成整個(gè)ADC制劑（DP）生產(chǎn)所需的設(shè)施需具備細(xì)胞毒素處理、活性化學(xué)反應(yīng)、生物制品及高分子量蛋白質(zhì)操作等綜合能力。

       理想情況下，偶聯(lián)工藝及后續(xù)純化、制劑過程不應(yīng)導(dǎo)致單抗與細(xì)胞毒素中間體產(chǎn)生新的降解或不穩(wěn)定途徑。但事實(shí)上，相較于親本單抗，這一新分子實(shí)體本身穩(wěn)定性降低，因此必須采取相應(yīng)措施以最大限度減少這些不穩(wěn)定因素。

       第一代ADC產(chǎn)品（Kadcyla?和Adcetris?）分別代表了基于賴氨酸和基于半胱氨酸的偶聯(lián)策略。Kadcyla?采用雙功能連接子SMCC（N-琥珀酰亞胺基-4-(馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯）：首先其琥珀酰亞胺基團(tuán)與曲妥珠單抗的多個(gè)賴氨酸側(cè)鏈反應(yīng)生成活化抗體，隨后SMCC連接子的馬來酰亞胺端基與DM1毒素上引入的巰基反應(yīng)，最終形成完整偶聯(lián)物。

       以Adcetris?為例的基于巰基的偶聯(lián)工藝中，首先采用三(2-羧乙基)膦（TCEP）對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵進(jìn)行可控還原，在抗體活化階段產(chǎn)生游離巰基。隨后通過馬來酰亞胺功能化的連接子-載荷復(fù)合物（含蛋白酶可切割的纈氨酸-瓜氨酸連接子及MMAE毒素）對(duì)這些游離巰基進(jìn)行標(biāo)記。與賴氨酸偶聯(lián)相比，半胱氨酸偶聯(lián)產(chǎn)生的偶聯(lián)產(chǎn)物分布更為均一。

       在賴氨酸與半胱氨酸偶聯(lián)過程中，均可能發(fā)生多種副反應(yīng)。琥珀酰亞胺或馬來酰亞胺的反應(yīng)活性在中性/堿性pH條件下增強(qiáng)，但該環(huán)境同時(shí)會(huì)促進(jìn)單抗發(fā)生脫酰胺反應(yīng)、焦谷氨酸形成及蛋白質(zhì)聚集。偶聯(lián)工藝需避免親核試劑干擾，并通過精確的pH控制平衡化學(xué)反應(yīng)活性與單抗穩(wěn)定性。

       偶聯(lián)異質(zhì)性也可從競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)角度分析：賴氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的可及性及反應(yīng)活性，既受整體溶液條件影響，也取決于單抗二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)中的局部微環(huán)境。由于這些微環(huán)境會(huì)隨單抗構(gòu)象的細(xì)微變化而改變，單抗結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定將直接影響偶聯(lián)異質(zhì)性和化學(xué)計(jì)量比。圖1.2展示了ADC分子在制造過程中承受的化學(xué)與物理作用力--根據(jù)工藝要求，單抗分子在活化與偶聯(lián)階段需接觸高溫、有機(jī)溶劑、還原劑及反應(yīng)副產(chǎn)物。此外，在抗體活化與偶聯(lián)過程中還涉及緩沖液置換、濃度調(diào)節(jié)、色譜分離等多步中間操作。這些處理步驟雖然能實(shí)現(xiàn)ADC物質(zhì)的富集或分離，但均可能引發(fā)物理不穩(wěn)定性。

       圖1.2 ADC產(chǎn)品在整個(gè)制造過程生命周期中的物理與化學(xué)作用力

       試劑的儲(chǔ)存、操作與質(zhì)量控制對(duì)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的偶聯(lián)反應(yīng)至關(guān)重要。以常用還原劑TCEP為例，其雜質(zhì)含量或濃度偏差會(huì)導(dǎo)致游離巰基生成不足，進(jìn)而降低偶聯(lián)效率；連接子在運(yùn)輸或儲(chǔ)存過程中若接觸濕氣，同樣可能造成不完全偶聯(lián)；而單抗的不當(dāng)處理也會(huì)如前文所述影響偶聯(lián)效果。偶聯(lián)位點(diǎn)與化學(xué)計(jì)量比會(huì)顯著影響ADC的療效與安全性特征，因此必須對(duì)這些關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)。

       1.2.2 下一代偶聯(lián)化學(xué)

       當(dāng)前，新一代偶聯(lián)化學(xué)技術(shù)的探索正在蓬勃開展，旨在拓展ADC的治療應(yīng)用范疇。這些突破或?qū)⑸羁逃绊懳磥鞟DC的工藝發(fā)展方向。如表1.2所示，重點(diǎn)研發(fā)方向包括：新型有效載荷的開發(fā)、替代性連接子技術(shù)的創(chuàng)新，以及能夠降低ADC異質(zhì)性的優(yōu)化生物偶聯(lián)策略。

       表1.2 新一代連接子-載荷及偶聯(lián)策略示例

       1.2.2.1 新型載荷的共軛

       在下一代ADC設(shè)計(jì)中，目前主要有四類具有重要臨床意義的細(xì)胞毒素--盡管這些毒素對(duì)整體ADC開發(fā)流程的影響差異不大。以Adcetris?（微管抑制劑奧瑞他汀類）和Kadcyla?（美登素類）為代表的微管蛋白抑制劑，以及基于DNA結(jié)合與嵌入機(jī)制的新型毒素。

       例如從棘孢小單孢菌中分離的天然產(chǎn)物卡奇霉素（calicheamicin），可通過結(jié)合DNA小溝并引發(fā)鏈斷裂發(fā)揮作用。這類抗腫瘤物質(zhì)作為ADC細(xì)胞毒素已探索多年，首個(gè)獲批ADC藥物Mylotarg?（吉妥珠單抗奧佐米星）即采用該毒素。另一類吡咯并苯二氮卓類（PBDs）化合物同樣通過DNA小溝結(jié)合與交聯(lián)發(fā)揮作用。雖然這類分子效價(jià)極高，但其強(qiáng)疏水性和光敏感性也帶來穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)。還有阿霉素等。（第一代ADC載荷）

       1.2.2.2 連接子的設(shè)計(jì)

       ADC連接子是一類多功能分子，既能確保ADC的穩(wěn)定遞送，又能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素載荷的靶向釋放。從ADC工藝與質(zhì)量控制的角度來看，連接子設(shè)計(jì)深刻影響著偶聯(lián)反應(yīng)條件及后續(xù)ADC產(chǎn)物的處理。這些分子既要提供連接細(xì)胞毒素與單抗的化學(xué)反應(yīng)位點(diǎn)，又需具備可控釋放載荷的功能結(jié)構(gòu)--當(dāng)ADC被內(nèi)化后，其骨架結(jié)構(gòu)能觸發(fā)毒素釋放。這些功能要求帶來的技術(shù)挑戰(zhàn)推動(dòng)了該領(lǐng)域的廣泛研究，并對(duì)ADC開發(fā)中的偶聯(lián)及下游工藝產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

       ADC連接子本質(zhì)上可分為不可切割型與可切割型兩大類。相較于可切割連接子，Kadcyla?采用的SMCC不可切割型連接子，以及添加了聚乙二醇（PEG）間隔基，在工藝開發(fā)和特性分析方面難度較低。而可切割連接子則利用酸不穩(wěn)定的腙鍵、可還原的二硫鍵或蛋白酶敏感的肽段（如纈氨酸-瓜氨酸）來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)毒素釋放。

       從工藝與生產(chǎn)穩(wěn)定性考量，必須對(duì)這些試劑進(jìn)行全程嚴(yán)格監(jiān)控：包括偶聯(lián)階段前后的總純度、微量降解物，以及可能影響穩(wěn)定性的各種因素。理想情況下，連接子切割應(yīng)僅發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。但事實(shí)上，ADC原藥在純化、制劑和凍干等下游工藝中，始終暴露于pH變化、溫度波動(dòng)、光照和空氣接觸等外部壓力，這些均可能導(dǎo)致游離藥物微量釋放，帶來全程毒性風(fēng)險(xiǎn)。因此，所有下游生產(chǎn)環(huán)節(jié)都需采用全面且正交的分析方法，既要檢測(cè)游離藥物及其相關(guān)降解形式，更要監(jiān)控ADC上連接子-載荷的脫落情況。

       以常見的硫代琥珀酰亞胺鍵為例（通過硫醇與馬來酰亞胺的邁克爾加成反應(yīng)形成）：該鍵可能通過琥珀酰亞胺水解或逆邁克爾反應(yīng)發(fā)生降解。雖然開環(huán)水解產(chǎn)物不會(huì)導(dǎo)致載荷釋放，但會(huì)改變ADC的溶液電荷狀態(tài)；而逆邁克爾反應(yīng)則會(huì)產(chǎn)生具有游離巰基反應(yīng)活性的載荷形式，可能與其他可及巰基形成蛋白質(zhì)-藥物偶聯(lián)物。這種連接子降解途徑不僅會(huì)降低ADC生物活性，還可能引發(fā)毒性隱患。

       1.2.3 抗體工程

       基于硫醇或賴氨酸的連接子化學(xué)面臨的核心工藝挑戰(zhàn)在于偶聯(lián)異質(zhì)性，這種異質(zhì)性是整個(gè)ADC工藝的關(guān)鍵控制點(diǎn)，需要建立全面的質(zhì)量控制和深入的表征分析，以確保符合質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況（QTPP）標(biāo)準(zhǔn)。以Kadcyla?為例，其曲妥珠單抗分子上最多可分布8個(gè)載荷，這一數(shù)量主要由SMCC連接子的活化步驟決定；而Adcetris?則通過TCEP控制二硫鍵還原程度來精準(zhǔn)調(diào)控藥物抗體比（DAR）。這兩種工藝都強(qiáng)調(diào)對(duì)反應(yīng)條件（濃度、pH、溫度和時(shí)間）及起始物料質(zhì)量的嚴(yán)格控制，這些因素直接影響產(chǎn)品放行必須達(dá)標(biāo)的DAR值，同時(shí)還需避免單抗本身的過度降解或結(jié)構(gòu)破壞。

       若能獲得更均一的ADC分子，將大幅簡(jiǎn)化從偶聯(lián)到下游的整個(gè)生產(chǎn)工藝與表征流程。目前已有若干創(chuàng)新技術(shù)正在開發(fā)中，表1.2列舉了部分代表性進(jìn)展，這些技術(shù)有望解決第一代ADC面臨的多種工藝挑戰(zhàn)。其優(yōu)勢(shì)包括：降低DAR相關(guān)的偶聯(lián)異質(zhì)性、減少未偶聯(lián)單抗殘留、改善載荷位點(diǎn)分布--所有這些特性均已被證實(shí)會(huì)影響ADC的治療窗和穩(wěn)定性。此外，F(xiàn)c功能與抗原結(jié)合親和力、體內(nèi)穩(wěn)定性與藥代動(dòng)力學(xué)特性、以及內(nèi)化后載荷釋放效率等，也都與偶聯(lián)程度和位點(diǎn)密切相關(guān)。

       定點(diǎn)偶聯(lián)策略主要包括：工程化半胱氨酸殘基技術(shù)和通過優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)引入非天然氨基酸。前者仍存在游離巰基引發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，可能形成分子內(nèi)二硫鍵錯(cuò)配，若巰基位點(diǎn)選擇不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。另一種定點(diǎn)偶聯(lián)方法利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（一種能催化谷氨酰胺與賴氨酸側(cè)鏈成鍵的細(xì)菌酶，該酶可識(shí)別IgG恒定區(qū)工程化的谷氨酰胺標(biāo)簽（LLQG），通過酶法或更優(yōu)的化學(xué)酶法策略可實(shí)現(xiàn)DAR值1-2的精確控制。

       這些技術(shù)都不可避免需要使用活性化學(xué)或生物化學(xué)方法將小分子連接子與細(xì)胞毒素連接到單抗上。在純化前的偶聯(lián)步驟中，抗體和連接子-載荷復(fù)合物會(huì)經(jīng)歷多種嚴(yán)苛條件，包括pH波動(dòng)（pH4-8）、高溫以及共溶劑（如二甲基亞砜DMSO、乙醇）處理。從工藝開發(fā)角度看，始終存在副反應(yīng)或降解風(fēng)險(xiǎn)，最終可能影響偶聯(lián)收率。表1.2所述的若干新一代偶聯(lián)技術(shù)采用了單抗一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾、改造表達(dá)系統(tǒng)或非天然氨基酸等策略，但工程化單抗的體外和體內(nèi)穩(wěn)定性可能不及現(xiàn)有上市抗體藥物那樣明確可靠。

       1.2.4 純化

       在獲得符合預(yù)期組分和活性的偶聯(lián)抗體后，粗產(chǎn)物需經(jīng)過純化流程以去除大部分低分子量組分。根據(jù)偶聯(lián)方案的不同，在抗體活化與偶聯(lián)步驟之間可能還需進(jìn)行中間純化或緩沖液置換。ADC的純化通常采用透析過濾技術(shù)--該技術(shù)體系通過使粗產(chǎn)物與特定截留分子量的超濾膜接觸，在泵壓驅(qū)動(dòng)下使低分子量物質(zhì)透過膜孔，而主要含ADC的高分子量物質(zhì)則被截留。該工藝同時(shí)可實(shí)現(xiàn)ADC原液的緩沖液置換和濃度調(diào)整，使其更符合制劑要求。

       透析過濾存在多種形式，尤其體現(xiàn)在規(guī)模差異上：小規(guī)模操作可通過離心或負(fù)壓實(shí)現(xiàn)超濾，而工業(yè)化生產(chǎn)則采用切向流過濾（TFF）等連續(xù)流系統(tǒng)。雖然大規(guī)模TFF能為ADC原液提供更溫和的處理環(huán)境，但空氣接觸、反復(fù)界面作用及溫度波動(dòng)等因素仍會(huì)帶來穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)（參見圖1.2及表1.1/1.3），進(jìn)而影響ADC關(guān)鍵質(zhì)量屬性。相較于未偶聯(lián)的IgG分子，ADC因攜帶多個(gè)疏水性修飾基團(tuán)而導(dǎo)致溶解性和穩(wěn)定性下降，這要求其純化過程需采取更專業(yè)的處理措施。

       表1.3 ADC的穩(wěn)定性特性及所采用的表征技術(shù)

       1.2.5 制劑處方

       ADC制劑開發(fā)需實(shí)現(xiàn)雙重目標(biāo)：在初步純化后產(chǎn)物穩(wěn)定，并為后續(xù)凍干、復(fù)溶及靜脈給藥提供適宜載體。因此，制劑工藝是連接純化ADC分子與臨床使用產(chǎn)品的關(guān)鍵橋梁。在上市批準(zhǔn)前，隨著ADC產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的逐步確立，其制劑方案從臨床前到III期研究階段會(huì)持續(xù)優(yōu)化。盡早明確給藥途徑對(duì)工藝開發(fā)至關(guān)重要--特別是在偶聯(lián)階段后，這將指導(dǎo)純化與制劑策略的制定。制劑作為ADC整體生產(chǎn)工藝的核心環(huán)節(jié)，其典型組成包括緩沖劑、糖類和表面活性劑，這些組分共同維持ADC溶液的穩(wěn)定性、凍干特性及復(fù)溶性能。

       相較于單抗制劑，ADC制劑存在兩個(gè)顯著差異：其一，ADC濃度范圍（Adcetris?：5mg/mL，Kadcyla?：20mg/mL）通常低于常規(guī)單抗制劑，因此對(duì)降低粘度的輔料需求減少；其二，連接子-載荷的化學(xué)穩(wěn)定性成為緩沖劑選擇和pH設(shè)定的關(guān)鍵考量因素。由于連接子-藥物組分引入的額外疏水性，制劑開發(fā)中需重點(diǎn)監(jiān)控聚集和構(gòu)象不穩(wěn)定性（參見圖1.2及表1.3）。對(duì)此必須采用正交分析和物化檢測(cè)技術(shù)，因?yàn)樗^察到的降解或不穩(wěn)定現(xiàn)象高度依賴于分析方法。

       盡管存在這些差異，ADC的長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估仍可借鑒單抗與小分子藥物開發(fā)積累的成熟技術(shù)體系。在質(zhì)譜等尖端分析技術(shù)蓬勃發(fā)展的今天，需注意這些方法的階段適用性。最終制劑開發(fā)階段，穩(wěn)定性指示方法必須具有長(zhǎng)期一致性和穩(wěn)健性，以支持ADC制劑表征所需的對(duì)比穩(wěn)定性研究，并確保在產(chǎn)品生命周期可能涉及的多產(chǎn)地生產(chǎn)時(shí)具備方法可轉(zhuǎn)移性。

       1.3 表征

       ADC產(chǎn)品的整體開發(fā)高度依賴于其表征方法。本文概述了用于ADC原液分析表征的技術(shù)體系，重點(diǎn)闡釋這些技術(shù)在ADC開發(fā)流程中的關(guān)鍵應(yīng)用節(jié)點(diǎn)。我們將結(jié)合ADC生產(chǎn)工藝（圖1.1，表1.3）及相關(guān)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（表1.1），簡(jiǎn)要介紹質(zhì)量控制（QC）工具的應(yīng)用框架。

       1.3.1 質(zhì)量與穩(wěn)定性測(cè)試

       ADC表征的一個(gè)顯著特點(diǎn)在于其活性分子固有的異質(zhì)性--即使是最純凈的狀態(tài)下，這種異質(zhì)性也遠(yuǎn)超出起始單抗本身的翻譯后修飾復(fù)雜性。目前已獲批的ADC產(chǎn)品均存在連接子-載荷在個(gè)數(shù)和位點(diǎn)分布上的分布差異，這就要求從偶聯(lián)階段開始就必須對(duì)這種化學(xué)異質(zhì)性進(jìn)行系統(tǒng)表征和控制。多個(gè)連接子-載荷基團(tuán)的共價(jià)連接會(huì)改變起始單抗的溶液性質(zhì)，進(jìn)而影響產(chǎn)品開發(fā)和表征策略。如表1.3所總結(jié)，ADC開發(fā)全過程必須進(jìn)行的表征包括：化學(xué)穩(wěn)定性、構(gòu)象穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性及總體溶液穩(wěn)定性。

       雖然現(xiàn)有多種分析技術(shù)可用于蛋白質(zhì)溶液特性研究，但那些能反映ADC關(guān)鍵質(zhì)量屬性、并提供穩(wěn)定性指示數(shù)據(jù)的檢測(cè)方法才是ADC生產(chǎn)工藝的核心。表1.3同時(shí)標(biāo)明了這些技術(shù)能解決的關(guān)鍵問題及其典型應(yīng)用階段。圖1.2和圖1.3則重點(diǎn)展示了在ADC產(chǎn)品生命周期中必須控制的多種外界作用力及降解途徑。

       圖1.3 ADC在整個(gè)生產(chǎn)過程中常見的降解途徑

       基于溶液的色譜與電泳技術(shù)是ADC開發(fā)中質(zhì)量控制表征的核心手段。這些方法主要定量檢測(cè)化學(xué)純度與穩(wěn)定性，也可部分反映構(gòu)象穩(wěn)定性。其中，尺寸排阻色譜（SEC）作為蛋白質(zhì)純化與分析的主要技術(shù)，能精準(zhǔn)識(shí)別和定量由聚集形成的高分子量物質(zhì)。結(jié)合多角度光散射（MALS）檢測(cè)，SEC-MALS可監(jiān)測(cè)ADC因載荷疏水性增加而導(dǎo)致的聚集傾向。即使低至1%的聚集水平（圖1.4a）也能通過SEC檢測(cè)，使其成為貫穿ADC生產(chǎn)流程的單抗穩(wěn)定性重要指標(biāo)。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）則能檢測(cè)更大粒徑的顆粒。

       疏水作用色譜（HIC）在ADC表征中的應(yīng)用日益廣泛，該技術(shù)通過檢測(cè)連接子-載荷數(shù)量增加導(dǎo)致的ADC分子疏水性變化（圖1.4b），可在常規(guī)HPLC或UPLC系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)定性定量的DAR分布分析，為質(zhì)量控制和穩(wěn)定性評(píng)估提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。DAR值測(cè)定的正交方法紫外-可見光譜需依賴連接子或毒素上的合適發(fā)色團(tuán)，但無法提供降解產(chǎn)物的分離信息。結(jié)合總蛋白分光光度檢測(cè)，HIC與UV-vis應(yīng)共同構(gòu)成半胱氨酸偶聯(lián)ADC的基礎(chǔ)QC方案。而賴氨酸偶聯(lián)ADC因異質(zhì)性更高，需采用LC-MS技術(shù)解析更多組分。ADC的LC-MS分析通常需要去糖基化和變性條件，但SEC-MS聯(lián)用技術(shù)可在非變性條件下進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)（圖1.4c）。

       圖1.4 常用ADC表征技術(shù)示例數(shù)據(jù)。(a) ADC的SEC圖。(b) 半胱氨酸偶聯(lián)ADC的HIC檢測(cè)DAR值圖。(c) 完整賴氨酸偶聯(lián)ADC的SEC-MS質(zhì)譜分析圖。

       成像毛細(xì)管等電聚焦（iCIEF）通過pH梯度凝膠分離，全程監(jiān)測(cè)單抗與ADC的電荷分布。如圖1.3所示，脫酰胺和賴氨酸截短（K缺失）等降解途徑會(huì)改變分子電荷分布特征。還原/非還原SDS用于檢測(cè)蛋白片段化。離子交換色譜（IEX）分析電荷態(tài)分布異質(zhì)性。HIC、SEC和IEX等色譜方法可在非變性條件下進(jìn)行，便于特定組分的分離制備或放大純化。

       反相HPLC主要用于細(xì)胞毒素和連接子衍生小分子的定量分析，常聯(lián)用MS提升靈敏度。鑒于毒性風(fēng)險(xiǎn)，該分析對(duì)指導(dǎo)偶聯(lián)后純化至關(guān)重要，并能檢測(cè)原液與制劑中游離毒素水平，通過識(shí)別多種潛在降解產(chǎn)物提供穩(wěn)定性指示。其色譜條件取決于連接子/毒素特性，相關(guān)方法開發(fā)可借鑒連接子-藥物的CMC數(shù)據(jù)。此外，因偶聯(lián)中使用的DMSO/DMF等有機(jī)溶劑具有毒性，需通過氣相色譜進(jìn)行殘留檢測(cè)。

       1.3.2 生化與微生物檢測(cè)

       采用ELISA法檢測(cè)ADC與起始單抗的抗原結(jié)合效價(jià)，可驗(yàn)證偶聯(lián)過程是否導(dǎo)致親和力下降。對(duì)于基于大腸桿菌或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)品，已建立成熟的殘留雜質(zhì)定量方法：包括qPCR檢測(cè)宿主細(xì)胞DNA、ELISA法檢測(cè)宿主細(xì)胞蛋白等。這些單抗相關(guān)雜質(zhì)必須在偶聯(lián)前完成質(zhì)量控制。

       對(duì)于基于工程化半胱氨酸、非天然氨基酸或新型表達(dá)系統(tǒng)的下一代ADC分子，可能需重新優(yōu)化上述檢測(cè)方法。該原則同樣適用于工程化抗體的血漿穩(wěn)定性及藥代動(dòng)力學(xué)-藥效學(xué)（PK-PD）特性評(píng)估--從表征角度而言，這類新一代單抗分子本身可能需被視為全新分子實(shí)體進(jìn)行系統(tǒng)研究。

       1.3.3 其他表征

       如同治療性蛋白藥物的開發(fā)，ADC原液或制劑也需進(jìn)行深入表征，以提供盡可能全面的特性鑒定、純度和穩(wěn)定性信息，從而降低產(chǎn)品開發(fā)整體風(fēng)險(xiǎn)。為滿足完整上市申報(bào)要求，需采用科學(xué)論證方法體系來確保原液和制劑在其市場(chǎng)生命周期內(nèi)的特性一致性和可比性可控。部分檢測(cè)方法雖不直接反映ADC穩(wěn)定性，但能提供特性鑒定信息，例如氨基酸序列確證、連接子-藥物位點(diǎn)占據(jù)率、單抗翻譯后修飾特征以及偶聯(lián)/純化/制劑工藝引發(fā)的結(jié)構(gòu)變化。反相高效液相色譜（RP-HPLC）肽圖分析作為蛋白藥物的常規(guī)指紋圖譜技術(shù)，在ADC表征中占據(jù)重要地位。質(zhì)譜技術(shù)是偶聯(lián)活化和偶聯(lián)步驟中評(píng)估異質(zhì)性的關(guān)鍵手段。更全面的分子分析則需要采用LC-MS/MS等技術(shù)來確認(rèn)氨基酸序列、單抗翻譯后修飾及化學(xué)修飾，氧化、脫酰胺等復(fù)雜修飾及糖鏈特征的精準(zhǔn)鑒定。

       圓二色譜（CD）、紫外-可見光譜和熒光光譜等光譜技術(shù)正日益廣泛地用于研究單抗構(gòu)象/膠體穩(wěn)定性及其與溫度的相互作用。通過CD光譜可估算α螺旋和β折疊含量，既可對(duì)比初始單抗數(shù)據(jù)，也可通過長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。內(nèi)源/外源熒光法已成功應(yīng)用于化合物結(jié)合或制劑穩(wěn)定性相關(guān)的二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)變化檢測(cè)。差示掃描量熱法（DSC）和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）等工具也正應(yīng)用于ADC熱力學(xué)研究。蛋白質(zhì)構(gòu)象完整性喪失或膠體不穩(wěn)定的起始點(diǎn)受制劑穩(wěn)定性影響。這些方法最適用于ADC原液純化后監(jiān)測(cè)連接子-載荷對(duì)單抗構(gòu)象的影響，在制劑優(yōu)化階段則可用于篩選穩(wěn)定輔料。此類方法提供的構(gòu)象穩(wěn)定性信息難以通過前述直接分子分析方法獲得。需注意的是，這些生物物理方法在ADC表征和制劑優(yōu)化中的普適性，很大程度上取決于所用連接子/載荷的光學(xué)特性、干擾因素及制劑組分。

       1.4 可比性

       與所有已上市原料藥及制劑相同，必須證明ADC在整個(gè)生命周期內(nèi)均能保持化學(xué)特性、藥理學(xué)特性及毒理學(xué)特性的一致性。從監(jiān)管角度而言，可比性研究的核心目的是確認(rèn)生產(chǎn)工藝的微小變更不會(huì)對(duì)制劑的安全有效性產(chǎn)生負(fù)面影響。這種理化特性與功能的一致性必須貫穿于原材料供應(yīng)商變更、生產(chǎn)場(chǎng)地變更及檢測(cè)設(shè)備變更的全過程。實(shí)現(xiàn)可比性的前提是：首先在偶聯(lián)工藝前建立單抗與藥物/連接子材料的適當(dāng)控制標(biāo)準(zhǔn)與驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)FDA要求，單抗及藥物/連接子中間體需接受與終產(chǎn)品原料藥同等水平的全面表征。對(duì)于單抗中間體，這包括完整的結(jié)構(gòu)、純度、穩(wěn)定性及生物學(xué)活性評(píng)估，以確保當(dāng)單抗生產(chǎn)發(fā)生變更時(shí)可進(jìn)行可比性判定。同理，偶聯(lián)用連接子/藥物分子也需完成結(jié)構(gòu)/元素分析、雜質(zhì)譜分析及穩(wěn)定性評(píng)估。隨后通過偶聯(lián)、純化及制劑階段的全面質(zhì)量控制與深度表征數(shù)據(jù)，建立與歷史批次或未來生產(chǎn)批次的可比性基礎(chǔ)?？杀刃栽u(píng)估與標(biāo)準(zhǔn)制定的復(fù)雜性不容低估--從早期臨床研究到產(chǎn)品上市期間將產(chǎn)生多個(gè)生產(chǎn)批次。ADC的可比性評(píng)估還存在額外復(fù)雜性：終產(chǎn)品由多個(gè)批次的單抗與連接子-藥物中間體共同構(gòu)成。鑒于特定分析結(jié)果與安全有效性之間的關(guān)聯(lián)可能尚未完全闡明，ADC的可比性研究可能還需補(bǔ)充臨床與非臨床體內(nèi)研究。

       1.5 結(jié)論

       ADC的生產(chǎn)融合了細(xì)胞毒性小分子藥物和單抗藥物開發(fā)的諸多復(fù)雜性?？傮w而言，基于單抗的穩(wěn)定性、偶聯(lián)異質(zhì)性以及這些關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）的表征，是ADC生產(chǎn)工藝和優(yōu)化開發(fā)方法的核心考量因素。ADC表征技術(shù)的發(fā)展速度與新一代ADC的創(chuàng)新步伐同步。預(yù)計(jì)隨著偶聯(lián)工藝的簡(jiǎn)化、ADC工藝認(rèn)知的深入，以及階段適配的表征工具的應(yīng)用，未來將催生更安全、更有效且更具成本效益的治療選擇。