雙特異性抗體（bsAbs）簡直是生物界的 "雙面間諜"，憑借一手 "左右開弓" 的結(jié)合絕技圈粉無數(shù)。它能同時盯上兩個抗原靶點，搞出 1+1>2 的協(xié)同效果，連傳統(tǒng)單特異性抗體組隊都得甘拜下風(fēng)。不過這位 "潛力股" 的成長之路可不順，設(shè)計構(gòu)建時總被各種麻煩絆住腳 -- 誰讓它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜度比傳統(tǒng)抗體高出好幾個段位呢。這些麻煩五花八門：外源抗原結(jié)合域一融合，生物物理穩(wěn)定性就掉鏈子；抗體鏈還總愛 "錯點鴛鴦譜"，結(jié)果生出些難以清除的 "雜質(zhì)寶寶"。想讓 bsAbs 既有預(yù)期的 "超能力"，又具備優(yōu)秀的 "藥界潛質(zhì)"，就得在設(shè)計時精打細算，再給它來一輪全方位的分子工程 "改造升級"。本文就來好好嘮嘮 bsAbs 設(shè)計里的那些關(guān)鍵考量，以及能高效打造不同分子形態(tài) bsAbs 的先進工程原理。

       簡介

       近年來，雙特異性抗體（bsAbs）在治療界可謂 "C 位出道"，為靶向治療打開了一扇新大門。它有個獨門絕技 -- 能同時對兩個不同靶點 "下手"，從而協(xié)同靶向疾病通路，這可是傳統(tǒng)免疫球蛋白組合想都不敢想的操作。雖說治療性 bsAbs 是人工工程的 "杰作"，但在自然界也能偶爾撞見它們的身影，比如通過 IgG4 半分子的 Fab 臂交換形成的那種。

       工程 bsAbs 的結(jié)合 "十八般武藝"，讓人們對它在多種疾病中的應(yīng)用浮想聯(lián)翩，癌癥、自身免疫性疾病、傳染病都可能被它攻克。最近有篇文章更是把雙特異性和多特異性藥物封為 "療法新勢力"。bsAb 的治療潛力讓這個領(lǐng)域成了 "香餑餑"，競爭那叫一個白熱化，但也催生出不少腦洞大開的工程奇跡，看看臨床階段 bsAb 五花八門的分子形態(tài)就知道了。

       作用機制

       bsAbs 的雙重結(jié)合能力，讓它的作用機制（MOA）比傳統(tǒng)單克隆抗體復(fù)雜得多，簡直像個精密的 "生物鐘表"。對很多 bsAbs 來說，想要發(fā)揮作用，兩個結(jié)合事件得在特定時間和空間 "約會"。也就是說，兩種結(jié)合特異性不僅得按特定物理排列 "站位"（比如把兩個靶標拉得近近的，誘導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)），還得講究 "時機"（比如同時連接細胞，或者按順序靶向跨越屏障）。

       有些 bsAbs 的作用機制，光靠兩個親本抗體 "組隊" 根本搞不定，這種就被稱為 "專性 bsAbs"。但就算沒有這種 "非它不可" 的機制，bsAbs 往往也不只是簡單的 "零件拼接"，效力常常比親本抗體組合強得多。據(jù)推測，這可能是沾了親和力的 "光"。

       雙重靶向還能提高靶標選擇性和定位精度，從而減少副作用，對于避免 "誤傷友軍"（也就是 "在靶、脫瘤" 效應(yīng)）特別有用。就算 bsAb 的活性和親本抗體組合差不多，它在生產(chǎn)上也有優(yōu)勢 -- 畢竟只需要生產(chǎn)一個分子，省事兒多了。

       BsAb 的雙靶向活性大致能分為 "順式" 和 "反式" 兩類。能不能把特定抗原結(jié)合域巧妙 "混搭"，針對性地作用于相同（順式）或不同（反式）的細胞 / 分子靶點，直接決定了 BsAb 能不能發(fā)揮協(xié)同功能。

       反式作用的 BsAbs 就像 "紅娘"，專找不同的靶點 "牽線搭橋"，形成物理連接。要是它結(jié)合的是不同細胞靶點，那作用機制就全靠把兩種細胞 "綁" 在一起，實現(xiàn)細胞間 "搭橋"。雙特異性 T 細胞銜接子就是個典型例子，它一邊勾搭腫瘤相關(guān)抗原，一邊聯(lián)系 CD3（一種超強共刺激受體），成功讓 T 細胞和腫瘤細胞 "見面"（圖 1A）。這貨還能繞過 T 細胞的自然活化流程，通過聚集低親和力 T 細胞受體，直接把 T 細胞 "騙" 到表達腫瘤相關(guān)抗原的細胞那兒去。

       "非反式" 這個詞在分子層面也有用武之地，比如雙互補位抗 HER2 bsAb，它結(jié)合的是兩個不同的 HER2 分子（非反式），而不是同一個（順式）。這種交叉結(jié)合能把相鄰分子連起來，誘導(dǎo) HER2 發(fā)生不一樣的重組，還能引發(fā)補體依賴性細胞毒性，這可是單特異性抗 HER2 抗體組合做不到的。這種分子非反式結(jié)合，主要和那些靶向同一抗原上不同且不重疊表位的雙互補位 bsAb 有關(guān)。

       順式作用的 bsAb 則像 "同小區(qū)保安"，主要盯著同一細胞上的抗原（圖 1B、C）。能激活同一細胞表面兩個受體的激動劑 bsAb（細胞順式激活），可以通過精確控制受體亞基 "牽手" 來選擇性調(diào)控信號傳導(dǎo)。比如有個靶向白介素（IL）-2 受體亞基 IL-2Rβ 和 IL-2Rγ 的 bsAb，它能通過中等親和力的 IL-2Rβγ 增強信號傳導(dǎo)，同時削弱高親和力 IL-2Rαβγ 的信號。還有個靶向死亡受體（DR）4 和 5 的雙重激動劑雙特異性 Surrobody，效力比親本抗體組合強，可能是因為它能讓 DR4 和 DR5 "抱團" 形成異二聚體。

       另一種順式激活 bsAbs 被稱為 "輔因子模擬器"，主要作用是幫酶和它的 "專屬底物" 找準位置（圖 1F）。凝血因子 FVIIIa 模擬物就是這么個角色，能促進 FIXa 和 FX "相遇"。這倆一旦 "組隊"，就會生成活化因子 Xa（FXa），這可是凝血途徑的關(guān)鍵 "推手"，所以這類 bsAb 和血友病 A 的治療關(guān)系密切。對于那些產(chǎn)生了抗 FVIII 同種抗體的患者來說，重組 FVIII 治療基本沒用，這種 bsAb 輔因子模擬物可就成了 "救星"。

       圖 1. bsAb的特異性作用機制。(A)反式細胞橋接通過 bsAb 在不同細胞之間建立了物理連接。該機制尤其適用于 T 細胞重定向 bsAb，因為這種物理連接有助于靶向激活 T 細胞的細胞毒性。(B)受體的順式橋接引起激動劑交聯(lián)，并激活相關(guān)的受體信號傳導(dǎo)。(C)順式拮抗作用阻斷受體結(jié)合，從而阻止信號通過受體復(fù)合物進行傳導(dǎo)。(D)搭載型 bsAb 利用一種特異性靶向受體，該受體有助于跨膜轉(zhuǎn)位到原本無法進入的區(qū)室，而另一種特異性則在此發(fā)揮其功能。閃電表示由抗體結(jié)合介導(dǎo)的活性。(E) BsAb可以發(fā)揮定位效應(yīng)。例如，激動劑 bsAb也具有腫瘤靶向特異性，通過將激動劑機制限制在腫瘤標志物存在的位點，限制了靶向、非腫瘤效應(yīng)。(F) BsAbs通過準確定位酶和底物充當輔助因子模擬物。

       也可以用拮抗性 bsAb 來 "搗亂" 信號通路，它們會霸占細胞受體，不讓可溶性受體配體 "靠近"。這類拮抗性 bsAb 常被用來阻斷免疫檢查點受體，這可是抗癌免疫治療里的 "明星靶點"。比如雙重阻斷免疫檢查點通路，或者同時盯上免疫檢查點和抗腫瘤免疫的負調(diào)節(jié)因子（像與不良預(yù)后相關(guān)的 TGF-β）。

       順式作用的拮抗性 bsAb 還能靶向相關(guān)或重疊的信號通路。所以這類 bsAb 可以一邊對付原發(fā)性癌癥相關(guān)通路，一邊處理那些可能因為原發(fā)通路被阻斷而 "冒頭" 的相關(guān)通路，從而阻止癌細胞 "逃之夭夭"。HER2xHER3 雙特異性抗體就是個例子，HER3 的上調(diào)可是 HER2 抑制劑耐藥的 "罪魁禍首"。

       激動劑型 BsAbs 的發(fā)現(xiàn)可比拮抗性的難多了，畢竟抗體的激動活性受一堆難以捉摸的因素影響。比如有研究發(fā)現(xiàn)，激動劑型抗 CD3 BsAbs 的細胞毒活性就和親和力、表位、分子幾何形狀脫不了干系。相比之下，有效的拮抗劑通常只要親和力高，能和天然配體 "搶位置" 阻斷其作用就行。另外，把 BsAbs 組合起來還能獲得治療效應(yīng)機制的額外協(xié)同效果，不過這可能會讓作用機制更復(fù)雜，給 BsAb 設(shè)計再添點 "麻煩"。

       Fc 的作用

       所有天然抗體都帶著個 "功能小助手"--Fc 區(qū)，它對抗體的效應(yīng)功能至關(guān)重要，通過和同源 Fc 受體以及補體蛋白等可溶性免疫介質(zhì)結(jié)合，觸發(fā)宿主細胞反應(yīng)。對 Fc 蛋白和糖進行 "改造"，能消除或大幅增強 Fc 介導(dǎo)的效應(yīng)功能，比如 NK 細胞的抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）、巨噬細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP），甚至某些 CD8 T 細胞反應(yīng)。

       人們在設(shè)計傳統(tǒng)單特異性抗體的 Fc 區(qū)上花了不少功夫，就是為了讓它具備天然同種型沒有的效應(yīng)功能（或者去掉某些功能）。比如給 IgG1 抗體加個 FcγR 沉默突變，就能造出效應(yīng)子減少的版本，但還保留著 IgG1 的優(yōu)良特性。反過來，搞搞糖工程，比如給 Fc-IgG1 N - 糖去掉核心巖藻糖，或者做點突變，能增強和某些 Fc受體的結(jié)合，從而提升效應(yīng)功能，像 FcγRIIIa 介導(dǎo)的 ADCC 或 ADCP。這些效應(yīng)調(diào)節(jié)突變或糖工程，通常和 bsAb 常見的突變（比如用于鏈轉(zhuǎn)向的突變）不沖突，所以在含 Fc 的 bsAb 里也能組合使用。

       根據(jù)預(yù)期的藥理作用（MOA），有些 BsAb 可能更適合 "改造" Fc 區(qū)，有些則完全不用動。臨床開發(fā)的 BsAb 大多都帶著 Fc 區(qū)，畢竟這個結(jié)構(gòu)域能用 Protein A輕松純化，而且 FcRn 循環(huán)還能延長半衰期。含 Fc 區(qū)的 BsAb 根據(jù)分子幾何結(jié)構(gòu)，大概能分成對稱型和非對稱型。

       雖說 Fc 區(qū)改造技術(shù)挺成熟，但有時候，基于小片段的 bsAb 比大型 IgG 樣 bsAb 更有優(yōu)勢?；谄蔚?bsAb 通常是把獨立抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過基因融合 "拼" 出來的，也能用多聚化結(jié)構(gòu)域組裝。這種方法的好處是，產(chǎn)物通常個頭小，還沒有重要的糖基化位點，用細菌或酵母這類簡單表達系統(tǒng)就能高產(chǎn)。

       基于片段的 BsAb 通常就一兩條多肽鏈，大大降低了因鏈錯配產(chǎn)生 "雜質(zhì)寶寶" 的風(fēng)險，這可是那些個頭大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的 BsAb 常遇到的頭疼事。而且，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過簡單基因融合，在價態(tài)和特異性組合上特別靈活，比如能搞出 1+3 和 3+3 的 BsAb 形式。

       傳統(tǒng)上，不含 Fc 區(qū)的基于片段的 bsAbs 多是用 scFv 片段做的，把它們以不同方式組合，能形成 BiTE、TandAb 或 DART 分子，這些都是 scFv 基片段 bsAbs 的主要類型（圖 2A）。不過 scFv 片段常有點 "小脾氣"，熱力學(xué)不穩(wěn)定，還愛搞 VH-VL 錯配，結(jié)果生成不想要的自組裝產(chǎn)物。

       scFv 的這些 "毛病" 讓人們把目光投向了單域抗體（sdAbs）。sdAbs 也是小個子（約 15 kDa）的抗原結(jié)合域，能通過基因融合形成基于片段的 bsAbs，而且它穩(wěn)定又結(jié)實，本質(zhì)上是單體，不容易發(fā)生不良自組裝。把 sdAbs 分別融合到 CH1 和 Cκ 上，不用接頭也能組合，借助恒定結(jié)構(gòu)域的自然配對作為二聚化基序，就能生成小的 Fab 樣 bsAbs。當然啦，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的組合方式還有很多，遠不止上面說的這些。

       基于片段的 bsAb 有個潛在 "短板"-- 個頭小又沒有 FcRn 結(jié)合區(qū)，所以清除得快。不過在某些應(yīng)用和形式中，這個問題已經(jīng)得到解決，比如把 bsAb 和 HSA 偶聯(lián)，或者加個抗 HSA 抗體片段。

       圖 2 .根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分類的最常見 bsAb形式的示意圖。（A）基于片段的 bsAb 是由不帶 Fc 結(jié)構(gòu)域的小抗原結(jié)合片段組合而成。其構(gòu)建單元通常是 scFv 片段或 sdAb。（B）對稱 Fc 結(jié)構(gòu) bsAb 由一到兩條多肽鏈表達，通常通過將額外的抗原結(jié)合片段融合到 IgG 骨架上來實現(xiàn)。（C）不對稱 Fc 結(jié)構(gòu) bsAb 由兩到四條多肽鏈組裝而成。不對稱 bsAb 需要采取措施避免鏈錯配。示意圖中的小"旋鈕"和"孔"用于一般性地表示需要使用鏈轉(zhuǎn)向技術(shù)來確保 HC:HC 異二聚化和/或正確的 HC:LC 配對的位置。

       對稱雙特異性抗體

       對稱型 bsAb 堪稱抗體界的 "標準款"，外形酷似 IgG，嚴格遵循 HC2LC2 的結(jié)構(gòu)套路。但別以為它就此墨守成規(guī) -- 它偷偷融合了額外的外源結(jié)合域，搖身一變成為能同時瞄準兩個抗原的 "雙料選手"。

       正因如此，這些 bsAb 大多是四價的 2+2 型雙特異性抗體（每種抗原各打兩槍），但若想升級火力，通過雙融合還能改造成六價的 2+4 型 bsAb。要說最常見的四價 2+2 型，那可就有不少成員了：scFv-IgG 融合體、DVD-Ig、串聯(lián) scFv-Fc、sdAb-IgG 融合體，還有 tetra-VH IgG（見圖 2），個個都是武林高手。

       對稱型 bsAbs 的一大 "懶人福利" 就是組裝起來特別省心，只需表達一兩條不同的多肽鏈就行。這意味著跟那些需要共表達三到四條多肽鏈的非對稱 bsAbs 比起來，它在初始篩選時，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的優(yōu)化工作簡直是小巫見大巫。而且 HC2LC2 結(jié)構(gòu)還大大降低了抗體鏈組裝出錯的概率，純化方案自然也就簡單多了。反觀非對稱 bsAbs，常常得額外加幾道純化工序，才能清除那些因組裝失誤產(chǎn)生的 "不合格產(chǎn)品"。

       不過，凡事有利有弊，HC2LC2 結(jié)構(gòu)也限制了價態(tài)的 "自由度"，因為抗原結(jié)合域總是成對出現(xiàn)。這就讓它在某些特殊場合束手束腳，比如遇到需要單價靶向以防止不良交聯(lián)的抗原（像 CD3 這種），就只能望洋興嘆了。

       在設(shè)計對稱型 bsAbs 時，選對外源抗原結(jié)合域可是個技術(shù)活。以前大家偏愛 scFv，畢竟它從常規(guī)抗體的 Fv 結(jié)構(gòu)域衍生出來很方便。但現(xiàn)在，小個子 sdAb 正憑借獨特優(yōu)勢異軍突起，成為炙手可熱的融合搭檔。它天生嬌小，還是單體，不像 scFv 那樣總愛搞 "小團體"-- 也就是不良自組裝和聚集，實在是省心不少。

       通常會用 10-25 個氨基酸的甘氨酸 - 絲氨酸接頭來融合外源抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這家伙在水溶液里柔韌性和穩(wěn)定性都沒得說，堪稱 "最佳粘合劑"。其他 bsAb 構(gòu)建體則另辟蹊徑，選用源自天然抗體接頭區(qū)域的接頭，比如抗體鉸鏈區(qū)，或者連接 Fv 和 CH1/Cκ 的柔性接頭。選對合適的接頭，對保證抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的正確間距和展示效果至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，接頭長度還會影響 DVD-Ig 分子的抗原結(jié)合能力和穩(wěn)定性，真是差之毫厘，謬以千里。

       抗體的模塊化特性簡直是設(shè)計師的福音，外源抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域既可以融合在支架多肽鏈內(nèi)部，也能接在末端，這樣就能打造出結(jié)構(gòu)五花八門的 bsAbs，完全可以根據(jù)需求量身定制。雖然這些外源抗原結(jié)合片段通常會跟全長 IgG 分子結(jié)合，但它們也能直接與 Fc 結(jié)構(gòu)域融合，讓構(gòu)建體比全長 IgG 分子小巧玲瓏，同時還能保留 Fc 區(qū)的功能，可謂一舉兩得。

       除了把獨立的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到 IgG 支架上，還有些別出心裁的策略用來開發(fā)對稱的 IgG 樣 bsAbs。比如四重 VH IgG，它通過把不同的結(jié)合特異性分配到 Fv 的每個可變域上（用獨立的 sdAb 替換 VH 和 VL）實現(xiàn)雙特異性。還有更絕的，把單個 Fab 域的 6 個互補決定區(qū)（CDR）在空間上分成 VH 互補位（CDRH1、CDRL2 和 CDRH3）和 VL 互補位（CDRL1、CDRH2 和 CDRL3），再把這些單獨的互補位組合起來，就形成了稱為 DutaFab 的單個雙特異性 Fab 域，真是把 "拆分重組" 玩得明明白白。

       非對稱雙特異性抗體

       非對稱 BsAb 的分子幾何結(jié)構(gòu)，讓它的設(shè)計和生產(chǎn)難度比對稱 BsAb 高出不少，這主要是因為不同抗體鏈共表達時，很容易產(chǎn)生抗體相關(guān)雜質(zhì)，就像一鍋粥里混進了沙子，讓人頭疼。盡管有這些實際難題，非對稱 BsAb 依舊在進入臨床開發(fā)的 BsAb 類型中占據(jù)主力位置，看來實力不容小覷。

       非對稱 BsAb 的一大顯著優(yōu)勢是，它的分子幾何結(jié)構(gòu)跟 IgG 的天然結(jié)構(gòu)長得很像，這就讓它能充分利用 IgG 良好的類藥特性，相當于站在巨人的肩膀上。而且非對稱結(jié)構(gòu)讓價態(tài)擁有了高度靈活性，比如能形成單價特異性（1+1），這可是對稱 bsAbs 辦不到的 "獨門絕技"。另外，那些結(jié)構(gòu)跟 IgG 分子相似度高的非對稱 bsAbs，被認為能降低免疫原性風(fēng)險，這可是個大大的加分項。不過要說明的是，非對稱 bsAbs 也能形成偏離嚴格二價 Y 形 IgG 幾何形狀的結(jié)構(gòu)，比如三價 2+1bsAbs，真是個靈活的多面手。

       HC:HC 配對

       非對稱雙特異性抗體（bsAb），最讓人頭疼的問題就是多肽鏈錯配，結(jié)果就是產(chǎn)生一堆產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，簡直是生產(chǎn)路上的 "攔路虎"。許多非對稱雙特異性抗體都得靠兩種不同重鏈（HC）的異二聚化來發(fā)揮作用，所以大家對能促進 HC 異二聚化的 HC 轉(zhuǎn)向平臺格外關(guān)注，都盼著能找到解決問題的鑰匙。

       目前已經(jīng)開發(fā)出不少 HC 轉(zhuǎn)向平臺，大多源自行業(yè)內(nèi)部，它們的工作原理是在 CH3 域中創(chuàng)建互補界面，而 CH3 域可是控制抗體結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵部位。不過，對結(jié)構(gòu)如此重要的 CH3 結(jié)構(gòu)域進行突變，常常也會影響 bsAb 的熱穩(wěn)定性，真是牽一發(fā)而動全身。

       雖然這些 CH3 轉(zhuǎn)向平臺的詳細設(shè)計原理在其他地方已有透徹的研究，但值得注意的是，這些平臺都在努力引入結(jié)構(gòu)互補的突變，目的是讓 HC 更傾向于異二聚化，同時抑制 HC 同二聚體的形成，就像在給 HC"牽紅線"，讓它們按指定對象結(jié)合。

       其中，第一個被報道且應(yīng)用最廣泛的平臺是旋鈕入孔（KiH）。它的操作很有意思，在一個 HC 里安插一個大個頭的色氨酸，在另一個 HC 里配上空間互補的小個子殘基，就像鑰匙和鎖一樣嚴絲合縫。KiH 策略之所以被廣泛采用，一是因為它在抑制 HC 同型二聚體方面效果顯著（除了極少量的孔 - 孔同型二聚體），二是因為它的專利已經(jīng)過期，不用再為專利費發(fā)愁。這樣一來，KiH 就為構(gòu)建不對稱 bsAb 提供了一條相對輕松又免費的路，要知道在這個領(lǐng)域競爭激烈，還多由行業(yè)主導(dǎo)，其他好幾個平臺都受專利保護著呢，想用上可不太容易。

       在構(gòu)建用于異二聚化的 HC 時，得明白 HC 異二聚體的相對豐度其實是一種平衡狀態(tài)，并非固定不變。這種平衡會受到多種因素影響，比如相對質(zhì)粒和表達水平，通常得通過優(yōu)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率來控制。這事兒可能相當費時間，尤其是在表達許多不同的 bsAb 時，簡直是對耐心的極大考驗。

       比如我們最近就報道了一種不對稱 IgG/sdAb-Fc 構(gòu)建體，調(diào)整 HC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率后，兩條 HC 鏈的表達才達到最均衡的狀態(tài)，這說明兩條 HC 可不會乖乖地平等共表達，還得靠人為調(diào)節(jié)。其他研究也發(fā)現(xiàn)，可變結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)會影響 HC 異二聚化，真是一環(huán)扣一環(huán)。

       CH1 結(jié)構(gòu)域在 IgG 分子的組裝和運輸中扮演著重要角色，這也解釋了為什么當 Fab 結(jié)構(gòu)域被 sdAbs 或 scFvs 等片段取代后，HC 的表達行為會發(fā)生變化。有趣的是，有人通過對高表達的 λ 鏈進行密碼子去優(yōu)化，來平衡表達量較低的 κ 鏈，居然還改進了異二聚 κλ bsAb 的組裝，實際上提高了目標 bsAb 的產(chǎn)量，這波操作真是讓人眼前一亮。

       HC:LC 配對

       在雙特異性抗體（bsAb）的世界里，HC 和 LC 的配對就像一場嚴格的相親大會。選擇擁有共同 LC 的 bsAb，就好比給相親雙方定了個共同的擇偶標準，能從源頭上消除錯配的尷尬。不過，要找到這樣的 "共同語言" 可沒那么容易，不僅耗時，還得在序列多樣性上做出讓步，這無疑給尋找既專一又深情（高親和力）的結(jié)合物增加了不少難度。

       但話說回來，共同 LC 這種方法也不是全無好處。它只需表達三條多肽鏈，在可制造性上算是松了口氣，就像原本要準備三桌飯菜，現(xiàn)在兩桌就夠了，確實省心不少。同理，找到有共同 HC 的 bsAb 也能避免 HC 錯配的問題，算是另一種 "捷徑"。

       其他方法則像是給 Fab 裝上了 "導(dǎo)航系統(tǒng)"，通過合理設(shè)計讓它們別走錯路，防止在不同多肽鏈共表達時鬧 "烏龍"。比如 Crossmab、正交 Fab 界面、交換 CH1/CL 結(jié)構(gòu)域、給天然鏈間二硫鍵做 "工程改造"，還有嫁接 IgE 衍生的異二聚化結(jié)構(gòu)域，這些操作都像是給抗體配對上了多重保險。

       使用兩種不同的 HC 和 LC，能讓 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域自由 "談戀愛"，在尋找靶向特異性 bsAb 時不受束縛，盡情展現(xiàn)多樣性?？闪硪环矫?，4 條多肽鏈要想平衡共表達，簡直比讓四個性格迥異的人同時合拍地跳一支舞還難。這就需要在載體設(shè)計和生產(chǎn)克隆生成上多花心思，甚至還會給下游工藝帶來額外壓力，像是一場艱難的協(xié)調(diào)工作。

       當然，也可以先讓每個抗體半單獨表達，之后再組裝成最終的 bsAb 構(gòu)建體，通過這種 "先分居后同居" 的方式得到正確的 HC:LC 配對。但這種策略就像在原本的生產(chǎn)流程中加了道 "中間商"，不僅要額外克隆生成和生產(chǎn)兩個組件，還得處理鉸鏈二硫鍵的充分還原和氧化等棘手步驟，簡直是給自己找麻煩。

       還有些策略更絕，把其中一個 Fab 臂換成單鏈 Fab（scFab）結(jié)構(gòu)域，讓 bsAb 只由 3 條多肽鏈組成。scFab 的柔性接頭就像個靈活的 "月老"，能促進 VH/CH1和 VL/CL 的正確配對。有意思的是，有些 Fab 域像是專一的 "癡情種"，天生就喜歡和同源的 HC:LC 配對；而另一些則是 "大眾情人"，在 HC:LC 配對上顯得比較隨意。研究發(fā)現(xiàn)，這種配對偏好主要由 CDR 決定，這些發(fā)現(xiàn)或許能幫我們在選擇兼容的 HC:LC 對或?qū)ふ页Ｒ?LC 時少走彎路。

       要是想從根本上避免 HC:LC 錯配的問題，還有個簡單粗暴的方法：用 scFv 片段或 sdAb 等抗體片段替換一個或兩個 Fab，讓 bsAb 最多只帶一個 LC，這樣就從源頭上杜絕了錯配的可能，堪稱 "釜底抽薪"。

       由于 bsAb 正確鏈配對太重要了，人們對高級分析和高效下游純化工藝的興趣也日益濃厚，畢竟得準確找出并清除那些 "錯配分子"，還得給它們定量呢。

       替代鏈轉(zhuǎn)向

       除了上面說的組裝方法，人們還探索了一些更依賴化學(xué)處理的策略，算是 "化學(xué)媒人" 的功勞。比如表達一種 IgG 樣 bsAb，它由 4 條不同的多肽鏈組成，以單一構(gòu)建體的形式表達?？贵w鏈之間通過連接子連接，這個連接子就像個 "指揮家"，控制著鏈的組裝，而且在表達后還能被去掉。給 BsAb 鏈加上亮氨酸拉鏈也能控制它們的結(jié)合，全長 IgG 分子還能通過 SpyTag/SpyCatcher 系統(tǒng)或者點擊化學(xué) "牽手成功"。

       分子幾何構(gòu)形

       BsAb 可不僅僅是各個部分的簡單相加，選擇最佳的分子結(jié)構(gòu)就像給房子選戶型，是獲得所需功能的關(guān)鍵設(shè)計考量。這意味著由相同分子構(gòu)建塊組成（總氨基酸含量相同），只是分子幾何形狀不同的 BsAb，可能會表現(xiàn)出天差地別的活性。

       雙重靶向通常是個復(fù)雜的活兒，因為 BsAb 的配置得同時考慮內(nèi)部和外部限制才能達到預(yù)期的治療效果。內(nèi)部限制是分子幾何形狀自身帶來的，比如結(jié)合域之間的空間位阻，就像兩個人站得太近會互相妨礙一樣。有研究檢查了一整套對稱的 sdAb-IgG bsAb，包括鏡像特異性，發(fā)現(xiàn)抗原結(jié)合域的結(jié)合親和力會受到分子幾何結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的域間空間位阻影響，而且當 sdAb 與 LC 連接時，這種影響比與 HC連接時更明顯。不過，這種內(nèi)部限制可以通過結(jié)構(gòu)工程來緩解，比如延長連接子，增加分子內(nèi)的靈活性和靶標結(jié)合之間的距離，就像把兩個吵架的人拉開點距離。

       外部限制則是由靶環(huán)境的空間組織造成的，BsAb 得擺出特定的 "姿勢" 才能實現(xiàn)所需的時空靶標結(jié)合。對于有細胞間活性的 BsAb 來說，這種外部限制尤為明顯，畢竟細胞表面受體的空間結(jié)構(gòu)本身就很復(fù)雜。比如，T 細胞活化所需的免疫突觸，就取決于 T 細胞抗原受體和肽 - MHC 配體的間距。既然通過 T 細胞重定向 BsAb 建立的人工免疫突觸和天然免疫突觸長得很像，那在設(shè)計這些 T 細胞重定向 BsAb 時，就得參考自然間距的限制，別搞 "非主流"。

       再舉個例子，當 Fynomer（源自 Fyn 激酶 SH3 結(jié)構(gòu)域的小結(jié)合蛋白）連接在 N端而不是 C 端時，F(xiàn)ynomAbs 的細胞毒活性更高。這說明，通過調(diào)整分子幾何形狀來實現(xiàn)最佳的位間定位，效果可能出奇地好。如果短位點間距更有利，那基于小片段的配置或許是個不錯的選擇。同樣，合理設(shè)計分子結(jié)構(gòu)和抗原結(jié)合域的位點間距，還能影響作用機理。在 T 細胞結(jié)合 scFv-IgG bsAb 中就得到了證實，將 scFv C 末端融合到 LC 上獲得的較短位點間距，在體外和體內(nèi)都展現(xiàn)出了更優(yōu)異的抗腫瘤效果。而且，靶向 CD19 和 CD3 的基于片段的 DART 分子，比由相同結(jié)合域組成的串聯(lián) scFv 表現(xiàn)出更好的細胞裂解作用，看來 DART 分子更緊湊的 "身材" 有利于維持細胞間接觸。

       受體空間組織的重要性，讓人們開始關(guān)注受體：抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析，希望能揭開有效抗體結(jié)合的秘密，從而設(shè)計出更棒的抗體療法。其實，位間距離不僅在細胞間靶向中很重要，對于兩個表位都在同一靶細胞上的 bsAb 也同樣關(guān)鍵。比如，雙位抗 HER2 bsAb 在非活性交聯(lián)構(gòu)象中有效捕獲 HER2 的能力，就很大程度上取決于分子幾何形狀，就像用合適的網(wǎng)才能網(wǎng)住特定的魚。

       鑒于 bsAb 結(jié)構(gòu)的影響這么大，想知道哪種 bsAb 最有效，光分析親本單特異性抗體可不夠。所以，我們得努力開發(fā)功能性篩選策略，不僅要評估親本抗體的結(jié)合能力，還得篩選組合 bsAb 組，看看哪種分子結(jié)構(gòu)和抗原結(jié)合域的組合最搭。

       而且，影響 bsAb 效力的不只是分子幾何形狀，還有特異性的相對方向。比如，把抗 HER2 scFv 與抗 PD1 IgG 支架融合，和反過來把抗 PD1 scFv 與抗 HER2IgG 融合相比，HER2 的結(jié)合率明顯降低，這說明 "誰站前面誰站后面" 影響還挺大?；谄蔚?bsAb 也有類似的情況，相對方向不同，效果可能就差遠了。

       在 bsAb 的設(shè)計中，不僅要優(yōu)化分子構(gòu)型和價態(tài)來達到所需的作用機制（MOA），還得優(yōu)化不同抗原結(jié)合臂之間的相對結(jié)合親和力。這可能就需要評估各種親和力變體的組合，才能找到最佳搭配，就像調(diào)配雞尾酒，比例對了味道才好。

       平衡結(jié)合親和力的重要性，讓人們對機制建模產(chǎn)生了興趣，希望通過它理解親和力相互作用，從而更科學(xué)地設(shè)計 BsAb。這種親和力調(diào)節(jié)對于靶向 CD3 和腫瘤相關(guān)抗原的 T 細胞結(jié)合 BsAb 來說尤其重要，而且相對結(jié)合親和力已經(jīng)被證明會影響療效和選擇性，可不能馬虎。

       可開發(fā)性考慮

       可開發(fā)性這檔子事，光讓雙特異性抗體（bsAbs）像神槍手一樣精準結(jié)合抗原還不夠，它還得具備一身 "好藥相"-- 比如表達量得像打了雞血一樣飆升，穩(wěn)定性得堪比老陳醋越放越香，別動不動就自己抱成一團（自交聯(lián)和聚集），溶解度也得給力不能掉鏈子。這些特質(zhì)合在一起，我們管它叫 "可開發(fā)性特征"。就像相親前得先看看照片篩一輪，藥物開發(fā)早期也得給 bsAbs 做個可開發(fā)性體檢，免得辛辛苦苦砸了錢，最后發(fā)現(xiàn)這貨根本成不了臨床候選的 "潛力股"。

       現(xiàn)在大伙兒都在忙著搞計算機預(yù)測工具和高通量分析，想在早期就揪出那些 "先天不足" 的候選者。但問題是，這些方法大多是給傳統(tǒng)單克隆抗體制訂的 "體檢標準"，用到 bsAbs 身上就得格外留神了 -- 畢竟給 bsAbs 搞工程改造時，很可能一不小心就捅出些意想不到的 "簍子"。比如說，我們最近就發(fā)現(xiàn)，把單鏈抗體（sdAb）嫁接到 IgG 這個 "支架" 上，表達量和穩(wěn)定性立馬就變了臉，而且變得有多離譜，全看分子的 "身材比例"、單鏈抗體接在 IgG 的哪個 "部位"，還有接上去的 "零件" 數(shù)量。這研究算是把話挑明了：分子的 "顏值即正義"（最佳幾何結(jié)構(gòu)）有多重要，單鏈抗體的 "體質(zhì)" 可不能光看單個零件或者它 "爹媽"（親本抗體）怎么樣就下結(jié)論。

       bsAbs 的 "造型設(shè)計" 可能引發(fā)的其他 "健康問題" 還不少，比如動不動就碎成幾段（碎片化）、特別愛扎堆（聚集傾向），還有工程改造出來的二硫鍵可能一言不合就 "鬧離婚"（還原）又 "復(fù)婚"（再氧化）。所以說，分子的 "身材" 在化學(xué)和生物物理穩(wěn)定性這兩塊，絕 對是設(shè)計時的重中之重。

       不光如此，分子的 "穿搭風(fēng)格"（形式）還會影響 bsAbs 在體內(nèi)的 "保質(zhì)期"（藥代動力學(xué)），大伙兒也在想辦法搞出能預(yù)測這一點的體外檢測方法。但架不住 bsAbs 的 "穿搭" 實在太多樣了，各種形式和 "身材" 讓人眼花繚亂，以至于到現(xiàn)在都沒法給它們的可開發(fā)性畫個統(tǒng)一的 "標準像"。

       雖然搞大規(guī)模的系統(tǒng)研究，說不定能總結(jié)出各種 "穿搭" 和 "身材" 的共同規(guī)律，但目前的做法通常是：要么在專利平臺的 "圈子里"，通過組合庫高通量篩選或者多參數(shù)優(yōu)化，找出那些 "體質(zhì)" 不錯的 bsAbs；要么就是走 "捷徑"-- 把單個表達的抗體組分用生物偶聯(lián)的方式拼起來，不用費勁吧啦地逐個生產(chǎn)，就能攢出一大堆 bsAbs 來篩選，這操作簡直是 "搭積木式" 高效。

       要是想針對性改善 bsAbs 的 "體質(zhì)"，就得對那些 "拖后腿" 的片段下功夫優(yōu)化。比如給片段 "強身健體"，讓它更耐熱、更易溶、化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，也別老想著 "抱團取暖"。但關(guān)鍵是，優(yōu)化完之后還得把它放回完整的 bsAbs 里再測一遍，免得 "單個零件給力，組裝起來掉鏈子"。

       對 "藥相" 的要求也能提前融入發(fā)現(xiàn)過程，比如在篩選的時候就給 "好藥相" 設(shè)點 "加分項"。

       結(jié)論

       雙特異性抗體（bsAbs）絕 對是治療界的 "潛力新星"，在各種醫(yī)療場景里都憋著一股狠勁想大顯身手。但這貨能不能成，全看設(shè)計和構(gòu)建夠不夠給力 -- 既得讓它治病夠猛，又得讓它的理化性質(zhì)夠乖，這平衡可得拿捏準了。

       就像前面說的，bsAbs 的 "戰(zhàn)斗力" 和 "表現(xiàn)分" 之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，全看它的 "結(jié)構(gòu)造型" 給不給力?，F(xiàn)在大伙兒都在使勁兒設(shè)計那種既能雙靶點 "開黑"，又能滿足開發(fā)要求，甚至能超越傳統(tǒng)單特異性抗體的 bsAbs。

       這篇文章掏心窩子分享的這些見解，就是想說明白 bsAbs 工程有多 "燒腦"，也想強調(diào)一句：想讓它的治療潛力徹底爆發(fā)，戰(zhàn)略設(shè)計這步棋必須走對。值得一提的是，我們深挖了工程策略和實際考量里的那些 "彎彎繞繞"，就是想弄清楚高效 bsAbs 設(shè)計里藏著的那些 "坑" 和 "機遇"。把這些設(shè)計原則的復(fù)雜門道捋清楚了，就能給 bsAbs 作為多功能 "治療利器" 的持續(xù)進化添磚加瓦，也能給未來更牛的 bsAb 療法研究開發(fā)指條明路。

       原文來源：A.V.Madsen, L.E.Pedersen, P.Kristensen, et al., Design and engineering of bispecific antibodies: insights and practical considerations. Front. Bioeng. Biotechnol., 2024.