抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是自然界中廣泛存在的一類(lèi)肽類(lèi)物質(zhì)，在生物體中發(fā)揮著抵御病原體感染的第一道防線作用。從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物，這些天然產(chǎn)生的肽類(lèi)分子在缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的生物體內(nèi)尤為重要，它們的防御機(jī)制完全依賴(lài)于先天免疫反應(yīng)，如無(wú)脊椎動(dòng)物。AMPs具有顯著的抗菌、抗病毒以及調(diào)節(jié)免疫的功能，被視為潛在抗生素替代品。但是，AMPs從實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床應(yīng)用仍存在挑戰(zhàn)，如AMPs存在較高的細(xì)胞毒性，可能對(duì)宿主細(xì)胞造成不可逆的損害。同時(shí)，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，在體內(nèi)極易被蛋白酶識(shí)別并降解，致使其穩(wěn)定性不足，難以在體內(nèi)維持有效濃度與活性狀態(tài)。

AMPs作用機(jī)制

1、穿孔模式

AMPs通常為陽(yáng)離子的堿性多肽，攜帶大量正電荷，而大部分菌膜的表面呈負(fù)電荷狀態(tài)。陽(yáng)離子AMPs因其攜帶的大量正電荷，在靜電作用力的吸引下，能夠有效地與細(xì)菌菌膜組分相互作用，促使AMPs在細(xì)菌表面大量聚集。一旦結(jié)合，這些AMPs會(huì)引發(fā)一系列菌膜損傷，從而發(fā)揮其抗菌作用。目前，研究人員廣泛認(rèn)可的細(xì)胞膜破壞模型主要有4種：聚合模型、桶板模型、環(huán)形孔模型以及地毯式模型。其中，桶板模型的研究最為深入，在該模型中，AMPs與細(xì)胞膜結(jié)合后，會(huì)垂直排列并相互聚集，形成圓柱狀結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞膜，從而在膜上形成孔洞。環(huán)形孔模型則闡述了AMPs與細(xì)胞膜結(jié)合后，致使膜向內(nèi)彎曲并形成孔洞的過(guò)程。地毯式模型表現(xiàn)為AMPs平行地結(jié)合到細(xì)胞膜表面，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，逐步分解膜，形成小顆粒。而在聚合模型中，AMPs與細(xì)胞膜表面的磷脂結(jié)合，形成肽-脂質(zhì)聚合物，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，引發(fā)細(xì)胞損傷。這些殺菌機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞膜變薄、改變細(xì)胞膜的彎曲度、形成孔洞等，進(jìn)而影響細(xì)菌細(xì)胞膜的整體膜電位，使其失去膜電位梯度，阻止ATP合成，終止細(xì)菌代謝，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

2、非膜穿孔模式

除了穿孔模式外，還有一些AMPs是借助細(xì)胞內(nèi)的靶向作用機(jī)制來(lái)抑制細(xì)菌、病毒等，此類(lèi)AMPs可以直接穿過(guò)細(xì)胞屏障到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中的各類(lèi)靶組分，通過(guò)滲透細(xì)胞膜或內(nèi)吞作用直接進(jìn)入菌體內(nèi)，在菌體內(nèi)可能有很多不同的作用靶點(diǎn)。AMPs可以通過(guò)干擾菌體內(nèi)的某些有活性的酶或分子，進(jìn)而影響正常的轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊以及細(xì)胞壁合成，有些AMPs也能夠抑制細(xì)胞壁脂多糖的形成，另外還可以抑制彈性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和糜蛋白酶等蛋白酶的活性，或通過(guò)DNA或RNA的降解抑制核酸合成中的一些關(guān)鍵酶，從而干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制，最終抑制細(xì)菌增殖。

抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化與改造策略

1、改變凈正電荷數(shù)量與分布

陽(yáng)離子抗菌肽主要是因?yàn)楦缓珹rg、Lys和His等堿性氨基酸殘基，正電荷多寡能影響抗菌肽與細(xì)胞膜帶負(fù)電荷磷脂的靜電吸附力及抗菌肽抑菌濃度。用精氨酸（Arg）和Lys替換Tenecin1結(jié)構(gòu)中α-螺旋區(qū)域的氨基酸殘基能增加凈電荷并顯著增強(qiáng)抗菌活性；用Lys替換抗菌肽Rr-AFP2第39位谷氨酰胺（Gln）可增強(qiáng)抗菌活性，而用Gln替換44位Lys后抗菌活性降低。還有研究將LV13K改造成凈電荷-5至+10的系列抗菌肽并發(fā)現(xiàn)，凈電荷-5至+8的系列抗菌肽抑菌活性隨凈電荷增加而增加，凈電荷為+8時(shí)抑菌活性最大，凈電荷增加至+10時(shí)，抑菌活性下降且溶血活性明顯增強(qiáng)?？咕钚耘c凈電荷并非簡(jiǎn)單正相關(guān)關(guān)系主要是因?yàn)閮綦姾蛇^(guò)高時(shí)，抗菌肽分子間靜電荷斥力超過(guò)抗菌肽與細(xì)胞膜磷脂的靜電吸附力，抗菌活性降低且增加細(xì)胞溶血活性。電荷和抗菌活性出現(xiàn)間接或完全反向關(guān)系可能是由于抗菌肽與磷脂頭基團(tuán)之間極強(qiáng)的相互作用阻止該肽易位到內(nèi)膜中。研究發(fā)現(xiàn)，含His殘基抗菌肽表現(xiàn)pH依賴(lài)性殺菌活性，在His殘基被質(zhì)子化的酸性pH下觀察到了抗菌活性顯著提高，主要是因?yàn)樵黾涌咕牡膬綦姾赡茉鰪?qiáng)與細(xì)胞膜表面相互作用，酸性pH值產(chǎn)生類(lèi)似金屬離子的作用。

2、調(diào)整抗菌肽的α-螺旋度

抗菌肽氨基端形成的α-螺旋空間構(gòu)象是雙親結(jié)構(gòu)形成的重要先決條件，對(duì)抗菌活性有重要影響，用正電荷氨基酸殘基取代非極性面能消除α-螺旋度并降低溶血活性，但對(duì)抗菌活性影響較小?？咕腗elittin氨基端Gly殘基替換為L(zhǎng)eu或去除能提高α-螺旋度，抗菌活性和溶血活性均有所增加。研究發(fā)現(xiàn)，在凈正電荷和肽鏈長(zhǎng)度不變的前提下，抑菌活性隨α-螺旋度消失而降低；用D-氨基酸替換L-氨基酸能降低抗菌肽α-螺旋度并降低溶血活性，是調(diào)整抗菌肽α-螺旋度的重要策略。有研究用D-型氨基酸替代抗菌肽melittin B的4個(gè)氨基酸殘基發(fā)現(xiàn)α-螺旋度降低了79.45%，抑菌活性不變，而動(dòng)物細(xì)胞毒性卻明顯降低；另有研究發(fā)現(xiàn)，D-型氨基酸比L-氨基酸更能有效降低動(dòng)物細(xì)胞毒性和增強(qiáng)抑菌活性。不過(guò)，α-螺旋肽雖有利穿膜且抗菌活性較高，但螺旋性過(guò)高會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞毒性，因此，需權(quán)衡α-螺旋度與抗菌活性及細(xì)胞毒性的關(guān)系。

3、提高抗菌肽蛋白酶耐受性

蛋白酶耐受性是抗菌肽在生物體內(nèi)應(yīng)用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。將抗菌肽結(jié)構(gòu)中帶正電荷的Arg用其他帶電荷的非天然氨基酸（如L-鳥(niǎo)氨酸和L-高精氨酸）或D-氨基酸取代，或通過(guò)N末端乙酰化阻止氨肽酶活性可增強(qiáng)抗菌肽蛋白酶穩(wěn)定性。將富含Lys的蜂毒肽抗菌肽（MPI）中所有氨基酸均用D-氨基酸取代，研究發(fā)現(xiàn)，改造后的D-MPI與MPI抗菌活性差異不顯著，且具備較好的胰蛋白酶耐受性，但制備成本極高；抗菌肽環(huán)化也能增強(qiáng)抗菌肽蛋白酶耐受性，環(huán)狀結(jié)構(gòu)和分子內(nèi)二硫鍵常賦予環(huán)化抗菌肽耐熱、耐酶解且抑菌活性高等理化性質(zhì)，如人防御素二硫鍵環(huán)化可極大提高其血清穩(wěn)定性，不過(guò)環(huán)化過(guò)程應(yīng)注意保留α-螺旋空間結(jié)構(gòu)，應(yīng)選擇在i和i+4環(huán)化（第1和第4個(gè)氨基酸被環(huán)化），避免i和i+6環(huán)化；擬肽是通過(guò)修飾肽鏈主側(cè)鏈骨架（如改變主鏈通過(guò)氮而非α-碳原子鍵合）增強(qiáng)消化耐受性而保留側(cè)鏈空間結(jié)構(gòu)獲得的類(lèi)似肽聚合物，擬肽環(huán)化還能增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透性和抑菌活性。

4、改變疏水性及平均疏水矩大小

疏水性強(qiáng)弱是決定抗菌肽進(jìn)入細(xì)胞膜磷脂層和膜通透性重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，抗菌肽疏水性太低，與細(xì)胞膜脂質(zhì)親和力較弱，膜穿透性較差，相反則易造成抗菌肽自我聚集和增強(qiáng)細(xì)胞毒性及溶血活性。疏水性在一定范圍內(nèi)與抑菌活性呈良好正相關(guān)關(guān)系，引入疏水基團(tuán)能拓展抗菌譜和增強(qiáng)抗菌活性，但疏水性過(guò)強(qiáng)易降低細(xì)胞選擇性和增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性，不宜超過(guò)50%。平均疏水矩對(duì)抗菌活性的影響要大于螺旋度和疏水性，合理調(diào)節(jié)平均疏水矩有利于提高抑菌活性。有研究將抗菌肽HP第16位Gln和第18位Asp用Trp替換，發(fā)現(xiàn)疏水性與抗菌活性均提高且呈良好正相關(guān)，平均疏水矩降低后，抗菌活性與溶血能力隨之降低。

5、改變抗菌肽的兩親性

兩親性是指抗菌肽結(jié)構(gòu)內(nèi)親水和疏水殘基或結(jié)構(gòu)域的相對(duì)豐度，可認(rèn)為是在一級(jí)序列及空間結(jié)構(gòu)上陽(yáng)離子殘基和疏水殘基之間的平衡。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，增加α-螺旋抗菌肽的兩親性可增強(qiáng)抗菌活性和降低紅細(xì)胞毒性，但也有研究認(rèn)為，兩親性增加會(huì)降低對(duì)紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性；β-折疊抗菌肽反向平行的β-折疊鏈也具有兩親性，通過(guò)二硫鍵形成穩(wěn)定構(gòu)象，當(dāng)從水溶液進(jìn)入細(xì)胞膜時(shí)不發(fā)生主要結(jié)構(gòu)改變，增強(qiáng)β-折疊抗菌肽的兩親性導(dǎo)致其溶血毒性增加，但對(duì)抗菌活性影響較小，表明兩親性和溶血之間存在相關(guān)性，而電荷和兩親性增加的indolicidin類(lèi)似物在抗菌活性不變的條件下卻顯示低溶血毒性，因此，抗菌肽兩親性與抗菌活性及紅細(xì)胞毒性關(guān)系復(fù)雜，尚不明確。

6、改變氨基酸殘基位置及肽鏈長(zhǎng)度

超過(guò)50%抗菌肽首位氨基酸殘基為Gly，富含Arg和Val的抗菌肽由于和細(xì)胞膜脂質(zhì)層有較強(qiáng)的靜電吸附力而發(fā)揮良好抗菌活性，富含Arg有助于膜穿孔，富含Val有助于形成β-折疊空間構(gòu)象和抗菌活性發(fā)揮，富含Pro和Gly對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)與抗菌活性發(fā)揮有重要作用。有研究逐一剔除抗菌肽P1的C端和N端氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pro是影響抗菌活性的關(guān)鍵氨基酸殘基；在研究富含Try的抗菌肽發(fā)現(xiàn)，Try殘基位置改變可影響抗菌活性，而改變Try殘基數(shù)對(duì)抗菌活性基本無(wú)影響；用Lys取代粘菌素序列（GIHDILKYGKPS）的His殘基會(huì)導(dǎo)致其抗菌活性降低，在N端添加Try殘基并同時(shí)用帶正電荷的Arg置換某些殘基可提高其殺菌活性。合適肽鏈長(zhǎng)度也是維持抗菌肽抑菌活性重要因素，含較多正電荷的較長(zhǎng)抗菌肽抑菌效果較好，而短鏈抗菌肽的正電荷增加其抑菌活性反而降低。

7、構(gòu)建雜合抗菌肽

應(yīng)用基因工程手段將attacin和thanatin融合構(gòu)建雜合肽attacin-thanatin并在大腸桿菌中成功表達(dá)，該雜合肽抗菌活性比單一attacin要高，且對(duì)豬紅細(xì)胞無(wú)任何毒性，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等也有較好抑菌活性；還有學(xué)者構(gòu)建了雜合抗菌肽Mel-MytB并在畢氏酵母中成功表達(dá)，該雜合肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)抑菌活性且耐熱和耐酸；還有研究制備的雜合抗菌肽HP-ma抑菌活性是HP和magainin的2～32倍，比magainin具有更好的膜裂解活性。

8、制備金屬抗菌肽提升抗菌活性與拓展抗菌譜

多肽是金屬離子配位螯合通用配體，多肽主鏈肽鍵中-NH2端、-COOH端和N原子及側(cè)鏈相關(guān)基團(tuán)可與金屬離子配位螯合并增強(qiáng)抗菌活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。如具有ATCUN基序的富組蛋白與Fe2+結(jié)合導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)喪失，抗真菌活性大大降低，而與Cu2+或Ni2+配位可增強(qiáng)抗真菌活性，與Zn2+配位螯合可增強(qiáng)抗菌活性。鐵調(diào)素為β-折疊肽，人鐵調(diào)素25與Cu2+螯合能增強(qiáng)對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性，因?yàn)镃u2+結(jié)合可誘導(dǎo)肽構(gòu)象變化，增加肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的抗菌活性，螯合Fe2+也能增強(qiáng)抗菌活性。與陽(yáng)離子抗菌肽作用機(jī)理不同，陰離子抗菌肽也可利用金屬配位離子與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中帶負(fù)電荷組分形成陽(yáng)離子鹽橋而穿透膜，若抗菌肽易位于細(xì)胞質(zhì)中，還可附著在核糖體或抑制核糖核酸酶活性，如Theromyzin。

參考資料

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