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褪黑素促進(jìn)骨再生作用機制的研究進(jìn)展（上）
上文中，我們介紹了褪黑素促進(jìn)骨再生作用的抗炎和抗氧化作用以及在成骨細胞分化和自噬的作用，本文繼續介紹褪黑素與成骨細胞凋亡和鐵死亡的關(guān)系以及對破骨細胞的作用機制和促進(jìn)血管生成的作用。
③褪黑素與成骨細胞凋亡
研究表明，褪黑素對成骨細胞凋亡的影響具有兩面性，且與褪黑素濃度密切相關(guān)。實(shí)驗發(fā)現使用高糖培養成骨細胞48h后細胞的凋亡率為40.8%，凋亡蛋白cleaved caspase 3的表達升高，而加入褪黑素后細胞凋亡率為28.3%，cleaved caspase 3的表達降低。這與另外兩項研究實(shí)驗結果相似，褪黑素干預后成骨細胞早期凋亡率、總死亡率以及Bax、caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達明顯降低。研究表明，褪黑素可以緩解并改善成骨細胞的凋亡水平，進(jìn)一步分析發(fā)現其與抑制成骨細胞氧化應激密切相關(guān)。褪黑素干預后可使枸櫞酸鐵銨和鋁作用成骨細胞造成ROS蓄積的結果得到緩解，使 ROS水平降低。研究表明褪黑素可使核因子紅細胞2相關(guān)因子2（Nrf2）途徑相關(guān)蛋白Nrf-2及HO-1表達進(jìn)一步的增加。Nrf-2是人抗氧化反應元件（ARE）的正向調節因子，Nrf-2通路的激活可以調節細胞內大量抗氧化基因產(chǎn)物的表達水平，并降低氧化應激水平，從而使凋亡水平降低，說(shuō)明褪黑素抑制成骨細胞的凋亡水平，可能與通過(guò)Nrf-2途徑抑制成骨細胞的氧化應激水平有關(guān)。
另有研究表明使用高濃度褪黑素干預成骨細胞，介導內質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）、調節STIM1，導致Septin4、Septin7表達增加以及細胞膜鈣升高，成骨細胞過(guò)量表達Septin4，可使細胞骨架破壞、細胞形態(tài)改變和細胞數量減少。這可能與細胞膜鈣升高，通過(guò)ERK途徑誘導成骨細胞都會(huì )使成骨細胞的凋亡明顯增加有關(guān)。
④褪黑素與成骨細胞鐵死亡
鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性的細胞死亡方式，是由于細胞內脂質(zhì)過(guò)氧化、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）抗氧化系統失調以及鐵超負荷所致，主要特征是細胞內活性氧的堆積和線(xiàn)粒體形態(tài)、膜電位的改變。多項研究表明，褪黑素對成骨細胞的鐵死亡具有抑制作用，且此作用與褪黑素改善成骨細胞氧化應激以及鐵自噬密切相關(guān)。首先，褪黑素通過(guò)調節Nrf2/HO-1、Wnt以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信號通路使成骨細胞氧化應激水平降低，從而抑制鐵死亡。研究表明褪黑素可以使高糖誘導成骨細胞發(fā)生鐵死亡導致的GPX4和胱氨酸?谷氨酸逆向轉運蛋白（SLC7A11）表達下調得到逆轉，從而抑制成骨細胞的鐵死亡。同時(shí)研究人員檢測核因子紅細胞2相關(guān)因子2（Nrf2）和血紅素加氧酶?1（HO-1）的表達水平，結果顯示在褪黑素組中的表達水平明顯高于高糖組，而在使用Nrf2?SiRNA干擾后，褪黑素對成骨細胞鐵死亡的改善作用則受到明顯抑制，這說(shuō)明其中Nrf2/HO-1通路起著(zhù)重要作用。值得注意的是，實(shí)驗發(fā)現鐵劑量依賴(lài)性下調Wnt靶基因以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k 信號通路相關(guān)基因的轉錄與表達，抑制其信號傳導，生成ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（LPO）。在使用褪黑素后可逆轉鐵抑制的典型 Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β /P70S6k 信號轉導，減少ROS和LPO的產(chǎn)生，改善氧化應激，預防鐵死亡，恢復鐵死亡對成骨細胞分化的抑制作用。其次，褪黑素可以調節miR-550a-3p/ELAVL1軸，改善鐵自噬來(lái)抑制成骨細胞的鐵死亡。ELAV樣蛋白1 （ELAVL1） 是一種RNA結合蛋白，能夠介導鐵自噬，使鐵蛋白降解，氧化應激水平升高，從而引起鐵死亡。 通過(guò)雙熒光素酶檢測發(fā)現miR-550a-3p能夠靶向作用于ELAVL1，褪黑素干預高糖培養成骨細胞后miR-550a-3p表達上調，調控ELAVL1表達下調，減少鐵自噬的發(fā)生，從而使鐵死亡得到抑制。根據上述實(shí)驗結果可知，褪黑素顯著(zhù)降低成骨細胞的鐵死亡水平是通過(guò)激活 Nrf2/HO-1通路、恢復Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信號通路傳導、上調miR-550a-3p，降低ELAVL1相關(guān)鐵自噬蛋白的表達實(shí)現的。
3、褪黑素對破骨細胞的作用機制
骨再生的控制不僅需要成骨細胞的調節，還需要破骨細胞的參與。破骨細胞源于造血干細胞，核因子κB 受體活化因子配體/核因子κB 受體活化因子(receptor actvator of nuclear factor-κBligand/receptor actvator of nuclear factor-κB，RANKL/RANK)通路的活化誘導破骨細胞的形成。骨保護素是基質(zhì)細胞產(chǎn)生的誘餌受體，與 RANKL 結合并阻止其與 RANK 的相互作用。同時(shí)，巨噬細胞集落刺激因子促進(jìn)破骨細胞前體的增殖和破骨細胞的存活。
褪黑素減少與骨吸收增加有關(guān)，提示褪黑素可能是一種內源性破骨細胞抑制劑。血清中的低褪黑素水平與骨質(zhì)疏松癥患者的低骨密度也表現出相關(guān)性。通過(guò)抑制 MT2 受體依賴(lài)的核因子κB信號通路促進(jìn)間充質(zhì)干細胞的成骨分化，并由 RANKL旁分泌下調破骨細胞的生成，表明褪黑素可能通過(guò)骨保護素/RANKL/RANK 軸影響成骨細胞系細胞和破骨細胞系細胞之間的相互作用。另有研究報道是褪黑素下調核因子κB 信號通路和活化 T 細胞核因子c-1 (NFATc1) 轉錄因子直接抑制破骨細胞的分化，而不涉及褪黑素受體。此外，褪黑素還上調骨細胞分泌降鈣素發(fā)揮對破骨細胞的抑制作用。在細胞水平上，褪黑素抑制 RAW 264.7 細胞在低濃度RANKL 和巨噬細胞集落刺激因子誘導下分化為破骨細胞。
4、褪黑素具有促進(jìn)血管生成的作用
骨修復需要血液供應和血運重建來(lái)恢復受損區域，血管化是骨再生的前提和關(guān)鍵環(huán)節。褪黑素促進(jìn)血管生成的機制是通過(guò)上調血管內 皮生長(cháng)因子水平促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細胞介導的血管生成，即促進(jìn)骨生成-血管生成偶聯(lián)。將骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)褪黑素處理，在得到具有更高表達水平的成骨相關(guān)標志物的同時(shí)，也得到更高表達水平的血管生成相關(guān)標志物，如血管內 皮生長(cháng)因子、血管生成素2和血管生成素4。褪黑素納米復合支架的成功制備，實(shí)現了褪黑素的長(cháng)效緩釋和成骨能力的增強。將褪黑素包埋絲素電紡絲 (melatonin-encapsuled silk Fibronin electrospun，SF@MT) 納米纖維植入大鼠臨界尺寸的顱骨缺損中，通過(guò)激活 PI3K/Akt信號通路，可顯著(zhù)促進(jìn)骨基質(zhì)沉積和新血管形成。負載褪黑素的納米纖維海綿支架 (Sca?old@MT) 的植入也顯著(zhù)改善了大鼠股骨遠端缺損的血管化骨再生。通過(guò)核因子紅系2 相關(guān)因子 2(nuclear factor-erythroid 2-Related Factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1) 信號通路，褪黑素納米復合支架可減少血管內皮細胞的氧化應激損傷以及直接刺激血管內 皮生長(cháng)因子的產(chǎn)生，從而逆轉糖尿病條件下骨生成-血管生成的解偶聯(lián)并促進(jìn)成骨。相關(guān)的骨組織工程的進(jìn)展進(jìn)一步證實(shí)褪黑素具有改善缺血組織血管生成的潛力，進(jìn)而加速骨修復。不過(guò)，也有研究指出，在腫瘤、年齡相關(guān)性眼病和低氧環(huán)境中，褪黑素抑制組織內新血管生成，這與骨愈合過(guò)程中的觀(guān)察結果相矛盾。
參考資料
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作者簡(jiǎn)介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事?tīng)I養食品的開(kāi)發(fā)與研究。
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