殼聚糖作為一種非病毒基因載體，由于具有良好的生物相容性、優(yōu)異的生物降解性、高陽離子密度和低毒性等特點，被廣泛認(rèn)為是一種理想的基因載體。研究發(fā)現(xiàn)，水溶液中殼聚糖能使磷脂雙層形成囊泡，直接破壞磷脂雙層疏水核心的結(jié)構(gòu)，還能打開上皮細(xì)胞間的緊密連接，便于大分子物質(zhì)通過上皮組織的運轉(zhuǎn)。不同相對分子質(zhì)量的殼聚糖/DNA復(fù)合物對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率一般比裸DNA、磷酸鈣法及聚L-賴氨酸/DNA復(fù)合物高，但比商品化的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine低。影響殼聚糖納米粒體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效果的因素有多種，主要和復(fù)合物顆粒大小、殼聚糖的相對分子質(zhì)量、殼聚糖和DNA的N/P比（殼聚糖的氨基和DNA的磷酸基之比）、pH、血清的濃度及殼聚糖的脫乙酰度等因素有關(guān)。復(fù)合物顆粒大小直接影響在體內(nèi)運輸和向靶細(xì)胞進入，從而影響基因的轉(zhuǎn)染率。研究認(rèn)為，15 kDa和52 kDa的殼聚糖聚合物能極大地提高熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)對人肺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，相對分子質(zhì)量大于100 kDa的轉(zhuǎn)染率比它們低，而七聚物(1.3kDa)沒有熒光素酶表達。此外，殼聚糖的脫乙酰度也是一種重要因素，因為它影響DNA的結(jié)合、釋放和基因在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)染率。脫乙酰度降低，DNA和殼聚糖的結(jié)合率降低，要形成完全的DNA復(fù)合物必須要有更高的N/P比。殼聚糖作為基因遞送載體，不同條件下對DNA的釋放有較大的影響，研究報道，在肝磷脂存在下高分子殼聚糖保持穩(wěn)定，而在聚合度為18的殼聚糖和肝磷脂共同保溫條件下，可降解并釋放DNA，釋放的DNA幾乎保持完全的超螺旋，平均聚合度為18的殼聚糖在高電荷比條件下和DNA能形成穩(wěn)定復(fù)合物，而且效率較高。

       殼聚糖衍生物作為基因載體的研究

       為了提高殼聚糖/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染率以使其更具有靶向性，人們對殼聚糖進行了修飾。

       ①半乳糖基化殼聚糖-接枝-聚乙二醇(G-CP)。

       研究報道，將半乳糖基和殼聚糖相連能使其對肝細(xì)胞具有靶向性，但缺點是轉(zhuǎn)染率很低。用半乳糖基低分子殼聚糖(Gal-LMWC)作為載體，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染率隨N/P比值的增大而增大，比值為5.6：1時達到最大值，因為半乳糖基密度增大時，復(fù)合物更容易和細(xì)胞表面的受體相互作用，從而提高轉(zhuǎn)染率。Gal-LMWC/DNA對HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率比HeLa細(xì)胞高，表明基因?qū)Ω渭?xì)胞的轉(zhuǎn)染是通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑。和其他載體相比，GAL-LMWC/DNA在HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率比裸DNA、CaP/DNA、HMWC/DNA、LMWC/DNA高，而比lipofectamine/DNA低。

       ②季銨化殼聚糖。

       首先利用殼聚糖寡聚物(<20個單體)合成三甲基殼聚糖(TMO)，再用季銨化為40%(TMO-40)和50%(TMO-50)分別和質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物，以DOTAP(一種陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑)相對照，對COS-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果為：DOTAP/DNA比裸DNA的轉(zhuǎn)染率高；殼聚糖寡聚物的轉(zhuǎn)染率是裸DNA的2～4倍；TMO-40/DNA顯示比TMO-50/DNA高的轉(zhuǎn)染率，配比為6:1和14:1時比裸DNA分別提高26倍和131倍。在10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中DOTAP/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染率顯著降低，而對TMO/DNA復(fù)合物的影響不大，對TMO-40的影響小于對TMO-50的影響。殼聚糖和三甲殼聚糖與DOTA相比無細(xì)胞毒性，而DOTAP使細(xì)胞活性降低50%。TMO/DNA復(fù)合物對HepG2細(xì)胞有特異的靶向性，可能通過復(fù)合物和細(xì)胞表面的半乳糖受體相互作用。

       ③殼聚糖/DNA-配體復(fù)合物。

       向殼聚糖/DNA復(fù)合物引入針對特定細(xì)胞表面受體的配體是提高轉(zhuǎn)染率的又一方法。比如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，這一系統(tǒng)基于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞而得到比較高的轉(zhuǎn)染率，不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染率不同。

       ④烷基化殼聚糖。

       首先制得十二烷基殼聚糖，與DNA通過靜電相互作用形成復(fù)合物。由于十二烷基殼聚糖的保護作用，DNA分子熱穩(wěn)定性提高。DNA酶解實驗表明，原始DNA酶解成碎片，而被十二烷基殼聚糖保護的DNA保持完好。

       ⑤脫氧膽酸改性的殼聚糖(DAMC)。

       脫氧膽酸是膽汁酸的主要成分，由于膽汁酸可在水中自締合，所以脫氧膽酸改性的殼聚糖也可自聚集形成平均直徑為160 nm的膠囊。當(dāng)N/P比為4:1時殼聚糖自聚體與質(zhì)粒DNA間即可形成復(fù)合物，粒徑在130～300 nm之間。以脫氧膽酸殼聚糖介導(dǎo)質(zhì)粒DNA對COS-1細(xì)胞(猴腎細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染率高于裸DNA，但低于lipofectamine試劑。

       ⑥咪唑烯酸修飾的殼聚糖。

       咪唑丙烯酸(uA)和可溶性殼聚糖通過酯化反應(yīng)得到咪唑丙烯酸修飾的殼聚糖(UAC)，N/P比在5～30之間的復(fù)合物DNA可抵抗脫氧核糖核酸酶I(DnaseI)降解而得到很好的保護。UAC/DNA復(fù)合物平均直徑小于100 nm，生理條件下復(fù)合物顆粒變大。但在高N/P值下，可形成150 nm左右的顆粒而滿足要求。N/P增大，zeta電位升高，比值大約為3時，可完全屏蔽DNA的負(fù)電荷，uA在UAC中含量增高，zeta電位增高。UAC對293T細(xì)胞(人腎上皮細(xì)胞系的一種)的生存能力沒有影響，且uA含量增加，細(xì)胞的生存能力提高，UAC對其它細(xì)胞的毒性也可忽略。對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率隨N/P比的增大而升高，復(fù)合物的轉(zhuǎn)染率隨著uA取代的增加顯著升高，但UAC/DNA復(fù)合物對HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率沒有升高，對NCTC3749細(xì)胞只有微弱的升高，表明該殼聚糖/DNA對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染有細(xì)胞特異性。

       ⑦兩性聚乙二醇?xì)ぞ厶恰?/strong>

       乙二醇?xì)ぞ厶墙?jīng)酸解得到不同相對分子質(zhì)量的聚合物，再結(jié)合十六烷?；?，其中一些附加N-甲基季銨基聚合度為22時，N/P比為2:1或更高時，DNA和載體能完全結(jié)合，粒徑為200～500 nm。含有N-甲基季銨基的載體，其濃度為10 mg/ml時也沒有溶血性。乙二醇?xì)ぞ厶怯捎诮到饧笆轷；囊攵a(chǎn)生細(xì)胞毒性，由于N-甲基的引入而恢復(fù)其生物相容性。降解的乙二醇?xì)ぞ厶?DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染率僅在A431細(xì)胞系(上皮癌細(xì)胞)中比陽離子脂質(zhì)體高，但有N-甲基季銨離子的復(fù)合物在A431和A549(肺腺癌細(xì)胞)細(xì)胞系中都高于陽離子脂質(zhì)體。聚合度在73～171范圍內(nèi)有轉(zhuǎn)染發(fā)生，聚合度再高則會影響復(fù)合物和細(xì)胞的結(jié)合，從而嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染率。用含有N-甲基季銨離子的載體體內(nèi)試驗，最佳聚合度為86，在肝臟和心臟的基因表達水平都優(yōu)于Exgen500(線性聚乙胺)和Superfect(一種陽離子聚合物，已經(jīng)商品化)。

       殼聚糖在基因治療中的應(yīng)用

       近年來，殼聚糖及其衍生物作為核酸的非病毒載體受到了廣泛的關(guān)注。殼聚糖可以通過分子主鏈中帶正電的伯胺與DNA/RNA中帶負(fù)電的磷酸基團之間的靜電相互作用與核酸分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。殼聚糖作為核酸遞送載體，不僅可以保護治療基因免受生理液體中內(nèi)切酶的降解，還能延長核酸分子的半衰期，從而提高轉(zhuǎn)染效率。

       ①遞送DNA

       殼聚糖被廣泛用作DNA的遞送載體。研究報道了一種用于DNA遞送的核-殼結(jié)構(gòu)三元復(fù)合物體系。該體系使用線性聚乙烯亞胺偶聯(lián)解聚殼聚糖作為DNA包封核心，PEG和細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPPs，序列為5~30個氨基酸)作為DNA包封外殼。該復(fù)合物通過帶負(fù)電的殼層和帶正電的核層之間的靜電相互作用形成，展現(xiàn)出良好的單分散性，其平均粒徑為120 nm，膠體穩(wěn)定性好。通過在體外和體內(nèi)實驗對三元復(fù)合物進行了評估，結(jié)果顯示該復(fù)合物具有較好核酸負(fù)載能力、細(xì)胞攝取能力及核酸轉(zhuǎn)染效果。然而，該系統(tǒng)與核酸的相互作用不足，核酸遞送的效率不佳。為了解決這一問題，有研究將殼聚糖引入聚乳酸-聚乙二醇(polylactic acid-polyethylene glycol，PLA-PEG)納米粒子中，旨在提高DNA在納米粒子中的包封效率，并增強對DNA酶解損傷的保護。實驗結(jié)果顯示，納米粒子的生物相容性顯著提高，DNA的釋放得到改善，并且在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染能力顯著增強，表明通過殼聚糖、PLA和PEG的協(xié)同作用，可實現(xiàn)這一目標(biāo)。

       ②遞送RNA

       用于治療應(yīng)用的調(diào)節(jié)性非編碼RNA分子可分為siRNA、微RNA(micro RNA，miRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)和反義RNA。這些分子容易被人血清中的核酸酶降解，導(dǎo)致生物利用度較低，并且無法通過帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，單獨使用受到極大的限制。殼聚糖的生物相容性及其陽離子性質(zhì)使其成為RNA遞送的潛在非病毒載體。研究人員針對殼聚糖的特定參數(shù)如分子質(zhì)量、脫乙?；潭群偷谆鶊F比，對RNA轉(zhuǎn)染能力進行了深入研究，以提高殼聚糖基多聚物的RNA遞送效率。為了進一步提升RNA的遞送效率，研究人員通過化學(xué)修飾以及在殼聚糖上接枝多肽或聚合物的方式，增強復(fù)合物的細(xì)胞穿透能力。其中，合成或天然的細(xì)胞穿透肽(如組氨酸、TAT、TAT-trans、CGKRK、精氨酸、聚L-精氨酸和魚精蛋白)的引入，不僅提升復(fù)合物穿透細(xì)胞膜的能力，還提升了復(fù)合物的穩(wěn)定性，更有效地保護RNA免受血清蛋白酶的降解。結(jié)果顯示，這類修飾顯著增強了細(xì)胞對復(fù)合物的攝取，同時顯著提高了核酸轉(zhuǎn)染和基因沉默能力。

       ③遞送CRISPR/Cas9

       CRISPR/Cas9是一種新興的基因編輯技術(shù)，已逐漸被研究者所認(rèn)可，并在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如鑒定疾病靶點、構(gòu)建細(xì)胞系模型、開發(fā)轉(zhuǎn)基因動植物等。與此同時，人們正在探索其作為腫瘤治療基因編輯工具的潛力。CRISPR/Cas9是由核酸酶Cas9蛋白和單個引導(dǎo)RNA組成的大分子復(fù)合物。無論是通過mRNA和單導(dǎo)RNA在細(xì)胞內(nèi)遞送合成表達核酸酶蛋白，還是直接遞送CRISPR/Cas9核糖核蛋白，都需要合適的遞送載體。雖然病毒載體以其高傳遞效率而聞名，但它們也存在固有缺點，如潛在的致癌風(fēng)險、插入大小的限制以及大規(guī)模生產(chǎn)的挑戰(zhàn)，這些都極大地限制了它們在CRISPR/Cas9傳遞中的應(yīng)用。相比之下，殼聚糖具有更大的有效載荷，可以更有效地遞送CRISPR/Cas9基因編輯工具。通過修飾富含殼聚糖的官能團，可以提高遞送的靶向性，并有效保護細(xì)胞中的核酸酶蛋白。研究報道了一種包裹紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的殼聚糖載體。該載體具有高負(fù)載能力，可以將Cas9 RNP(一種帶有聚谷氨酸肽標(biāo)簽的工程蛋白)和DNA供體遞送到特定細(xì)胞進行基因編輯，還有研究開發(fā)了一種功能化反應(yīng)性殼聚糖載體，可遞送sgVEGFR2/Cas9質(zhì)粒和紫杉醇用于肝癌治療。

       參考資料

       [1]李華安,李志揚,林博涵,等.殼聚糖作為核酸遞送載體在基因治療中的研究進展[J].中國新藥雜志,2025,34(07):713-719.

       [2]趙雪,任慧霞.殼聚糖及其衍生物作為基因遞送載體的研究進展[J].食品與藥品,2006,(02):1-5.

       作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。